【摘要】：雌激素在魚類性別決定、分化與維持中起著關(guān)鍵的作用,但其作用機(jī)制有待闡明。雌激素的作用主要通過(guò)其核受體(Estrogen receptor,ER)介導(dǎo)。與多數(shù)硬骨魚類一樣,尼羅羅非魚有3個(gè)雌激素受體亞型:ERα,ERβ1和ERβ2。在尼羅羅非魚中,是哪個(gè)受體介導(dǎo)雌激素在性別決定中起作用,雌激素受體轉(zhuǎn)錄調(diào)控的與性別決定直接相關(guān)的下游靶基因及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的機(jī)制仍是未知的。近年來(lái),雌激素受體的特異性激動(dòng)劑和拮抗劑的開(kāi)發(fā)及本實(shí)驗(yàn)室首次在養(yǎng)殖魚類建立的CRISPR/Cas9系統(tǒng),為揭示雌激素在羅非魚性別決定與維持中的作用以及所涉及的機(jī)制提供了強(qiáng)有力的手段。本研究擬通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄激活和CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除兩種方法,對(duì)兩個(gè)ER?在性別決定中的作用進(jìn)行功能研究。研究結(jié)果如下:1)羅非魚ER特異的激動(dòng)劑和拮抗劑的篩選。離體實(shí)驗(yàn)表明,雌激素E2(17β-Estradiol,E2)通過(guò)ERα,ERβ1和ERβ2以劑量依賴方式誘導(dǎo)熒光素酶的活力,EC50分別為1.9×10-9M,1.6×10-12M,2.9×10-10M,且雌激素對(duì)ERβ亞型的結(jié)合能力是ERα的100倍左右。其次,本研究利用GAL4系統(tǒng)檢測(cè)哺乳類ER的激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)尼羅羅非魚3個(gè)ER活性的影響,篩選出羅非魚ER各自特異的激動(dòng)劑和拮抗劑。研究結(jié)果表明:哺乳類ERβ特異的激動(dòng)劑WAY只能特異的激活羅非魚ERβ2的活性,而對(duì)ERα和ERβ1無(wú)轉(zhuǎn)錄激活作用;哺乳類ERβ特異的拮抗劑PHTPP對(duì)羅非魚ERβ1和ERβ2的活性有顯著地抑制作用,而對(duì)ERα無(wú)抑制作用。哺乳類ERα特異的激動(dòng)劑PPT和拮抗劑MPP對(duì)羅非魚3個(gè)ER都無(wú)特異性的激活和抑制作用。說(shuō)明哺乳類ER的激動(dòng)劑和拮抗劑并不能完全適用于羅非魚的3個(gè)ER。2)羅非魚ERβ基因突變系的建立。利用CRISPR/Cas9基因靶向編輯技術(shù),分別在尼羅羅非魚敲除雌激素受體ERβ的2個(gè)亞型(ERβ1和ERβ2)�；蚯贸陌形稽c(diǎn)分別位于ERβ1的第5個(gè)和ERβ2第4個(gè)外顯子上,選擇靠近PAM(Protospacer adjacent motif,PAM,原型間隔基序)區(qū)的限制性內(nèi)切酶Bts IMut I和Hpy188I,用于ERβ1和ERβ2 F0代基因敲除陽(yáng)性魚的篩選。將ERβ1(突變率為46%)和ERβ2(突變率為90%)F0代XY陽(yáng)性雄魚分別和野生型XX雌魚雜交,獲得F1代個(gè)體。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)進(jìn)行篩選,17尾為ERβ1+/-雜合突變魚,7尾為ERβ1+/+野生型魚,陽(yáng)性率為70.8%。將篩選的ERβ1+/-魚的PCR產(chǎn)物亞克隆測(cè)序,結(jié)果顯示,突變魚中既檢測(cè)出了移碼突變(-13bp,-5bp,-2bp,+11bp,+11bp)又檢測(cè)出了非移碼突變(-39bp)。同樣,篩選的21尾ERβ2 F1代,12尾為ERβ2+/-雜合突變魚,9尾為ERβ1+/+野生型魚,陽(yáng)性率為57.1%。突變魚中既檢測(cè)出了移碼突變(-11bp,+7bp)又檢測(cè)出了非移碼突變(-6bp)。選取有移碼突變ERβ1(-13bp)和ERβ2(-11bp)的XY與XX雜合子交配獲得純合突變的F2。3)F1代性腺組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明,在孵化后120和180天(dah,days after hatching)時(shí),野生型ERβ+/+XX魚的卵巢充滿II時(shí)相的卵母細(xì)胞,而ERβ1+/-XX魚的卵巢仍被卵原細(xì)胞和少量I時(shí)相的卵母細(xì)胞中所充滿。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明,與對(duì)照魚相比,雌激素合成酶Cyp19a1a和生殖細(xì)胞標(biāo)記Vasa在ERβ1+/-雜合敲除魚性腺正常表達(dá),而Ⅰ、Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞標(biāo)記42Sp50的陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。這些結(jié)果表明敲除ERβ1的雜合子可能因單倍劑量不足導(dǎo)致XX魚卵巢卵子發(fā)生明顯延遲。相反,在120和180 dah對(duì)ERβ2+/-XX魚性腺?zèng)]有明顯的表型,其卵巢與野生型卵巢一樣充滿II時(shí)相的卵母細(xì)胞。性成熟后,無(wú)論XX和XY ERβ1+/-雜合敲除魚還是ERβ2+/-雜合敲除魚都是可育的。通過(guò)姊妹交均獲得了純合敲除魚。4)F2代性腺組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明,在30和90 dah,所有XX ERβ1-/-和ERβ2-/-純合敲除魚都與XX野生型一樣表達(dá)Cyp19a1a,不表達(dá)Dmrt1,而XY ERβ1-/-和ERβ2-/-都與XY野生型一樣表達(dá)Dmrt1,不表達(dá)Cyp19a1a,從而說(shuō)明無(wú)論單獨(dú)敲除ERβ1和ERβ2都不會(huì)發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。這可能是由于敲除其中一個(gè)ERβ而另一個(gè)ERβ或ERα?xí)a(bǔ)償其功能。因此,還需要建立ERα單敲除、ER雙敲除乃至三敲除模型做更進(jìn)一步的研究。綜上所述,哺乳類ER的激動(dòng)劑和拮抗劑不完全適用于羅非魚的3個(gè)ER,還需要篩選ER各自特異的激動(dòng)劑和拮抗劑來(lái)揭示它們介導(dǎo)雌激素決定羅非魚性別的作用機(jī)制。分別純合敲除ERβ1和ERβ2在早期沒(méi)有發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。但是ERβ1和ERβ2敲除模型的建立為后續(xù)建立ER雙敲除及三敲除模型,以及深入解析雌激素及通過(guò)哪個(gè)(哪些)ER在性別決定、分化和維持中的作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[Abstract]:The mechanism of estrogen receptor - specific agonist and antagonist against estrogen receptor 尾 1 and ER 尾 2 in tilapia was studied . The results showed that estrogen receptor 偽 , ER 尾 1 and ER 尾 2 could only activate the activity of ER 尾 2 in tilapia . The results showed that estrogen receptor 偽 specific agonist and antagonist MPP had no specific activation and inhibitory effect on the ER 尾 1 and ER尾 2 . The results showed that the ovary of wild type ER尾 1 + / - XX fish was full of phase II at 120 and 180 days ( dah , days after hatching ) . and in - depth analysis of estrogen and the role of ER in determining , differentiation and maintenance of sex lays a solid foundation .
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4;Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 田海峰;孟彥;胡喬木;肖漢兵;;兩棲動(dòng)物的性別決定研究新進(jìn)展[J];四川動(dòng)物;2014年05期

2 周林燕 ,張修月 ,王德壽;脊椎動(dòng)物性別決定和分化的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J];動(dòng)物學(xué)研究;2004年01期

3 王德壽,吳天利,張耀光;魚類性別決定及其機(jī)制的研究進(jìn)展[J];西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2000年03期

，

本文編號(hào)：2134802