【摘要】：近年來,嗜熱酶已經成為酶工程領域的一個重要研究方向,嗜熱真菌產生的胞外酶在極端環(huán)境下活力相對更高,穩(wěn)定性更好。具有良好熱穩(wěn)定性的酶在工業(yè)生產和生物質能源開發(fā)上具有一定的優(yōu)勢。嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)是一種溫和的嗜熱真菌,最適生長溫度介于25-55℃之間,屬于絲狀子囊真菌(Ascomycetous fungus)。嗜熱毀絲霉的基因組已子2011年完成測序。通過對基因組信息的分析顯示嗜熱毀絲霉能產生200多種葡萄糖苷水解酶和大量的與纖維素和半纖維素降解有關的輔助蛋白。我們從誘導和非誘導培養(yǎng)條件下嗜熱毀絲霉的轉錄譜對比中,篩選出可能參與真菌纖維素酶表達調控的因子STL1和AZF1,并利用同源過表達和RNAi技術對它們分別進行了研究。主要內容如下:(1)本文克隆了嗜熱毀絲霉MtSTL1的基因序列,構建重組過表達載體,使用MtPpdc及MtTpdc終止子對該基因進行了同源過表達,并進行酶活測定、熒光定量PC R等實驗。研究過表達糖轉運蛋白STL1與真菌纖維素酶活性之間的關系。實驗成功篩選得到3株重組轉化子,其中在轉化子S02中,stl1的表達量最高達到野生型菌株該基因表達量的1653倍。在誘導培養(yǎng)條件下生長至第5天時,轉化株S02的濾紙酶活和β-葡萄糖苷酶活分別比野生型提高18.6%和49.9%。利用熒光定量PCR技術分析了相對應的纖維素酶基因的mRNA轉錄水平,也發(fā)現(xiàn)了轉化株S02中的主要纖維素酶相關基因cbh1,cbh2,egl1,egl3,bgl1的表達量分別是野生型菌株的3.28、2.70、1.66、1.79和1.55倍。本實驗結果表明,stl1基因的過表達對嗜熱毀絲霉纖維素酶活性具有增強作用,其中β-葡萄糖苷酶(BGase)的表達提高對總纖維素酶活性提高起主要作用。(2)以嗜熱毀絲霉中具有C2H2結構域的AZF1轉錄因子為研究對象,設計azf1基因的siRNA干擾序列,利用嗜熱毀絲霉pdc基因的強啟動子構建azf1基因的沉默表達盒。實驗通過引物特異性PCR驗證及測序比對,成功獲得3株轉化子。通過熒光定量PCR分析azf1基因的mRNA表達水平,發(fā)現(xiàn)其中菌株A02沉默效果最明顯,但是azf 1基因還是有70.8%的表達量,未能達到預期20%及以下的期望,表明三株轉化子在嗜熱毀絲霉內都未有效實現(xiàn)RNAi。取效果最好的A02轉化子做纖維素酶活性測定和蛋白濃度測定,發(fā)現(xiàn)在非誘導條件下總蛋白含量有一定增加,濾紙酶活(FPA)、內切纖維素酶酶活(EG)、及β-葡萄糖苷酶活性(BG)均沒有穩(wěn)定且明顯的區(qū)別,推測是因為RNAi的效果不夠理想。分析可能的原因有:設計的siRNA不佳;轉化效率低下;插入位點的隨機性造成表達盒未能有效轉錄表達siRNA;脫靶效應。
[Abstract]:In recent years, thermophilic enzymes have become an important research direction in the field of enzyme engineering. The extracellular enzymes produced by thermophilic fungi have higher activity and better stability in extreme environments. The enzyme with good thermal stability has some advantages in industrial production and biomass energy development. Myceliophthora thermophila is a mild thermophilic fungus with the optimum growth temperature of 25-55 鈩，

本文編號：2125358