發(fā)布時(shí)間：2018-07-15 17:10

【摘要】：牛肉中高含量的不飽和脂肪酸不但改善了牛肉的風(fēng)味,而且增加了牛肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFA:DHA,22:6n-3;EPA,20:5n-3)有助于降低人類(lèi)患心血管疾病、癌癥、二型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn);在胎兒期對(duì)于完善大腦的功能、視覺(jué)的形成起到關(guān)鍵作用;也維持正常生理狀態(tài)下神經(jīng)和視覺(jué)的功能。長(zhǎng)鏈脂酰Co A合成酶1(Long-chain acyl-Co A synthetase 1,ACSL1)對(duì)脂肪酸的激活、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解以及合成起到關(guān)鍵作用。QTL分析認(rèn)為ACSL1作為最重要位置和功能上的候選基因,直接影響牛肉骨骼肌中多不飽和脂肪酸的組成。ACSL1基因多態(tài)性與牛肉骨骼肌中脂肪酸組成和比例呈顯著相關(guān),但目前對(duì)于該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未報(bào)道。為闡明調(diào)控牛肉骨骼肌中多飽和脂肪酸組成的分子機(jī)制,改善牛肉品質(zhì),提高牛肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,培育高品質(zhì)肉牛品種。本研究以秦川牛肉用新品系為研究對(duì)象,從細(xì)胞水平對(duì)關(guān)鍵肉質(zhì)性狀A(yù)CSL1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)采用5￠末端c DNA快速擴(kuò)增法(SMART RACE c DNA Amplification),確定牛ACSL1基因存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),它們位于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游20659,20656,20608以及3 bp位。我們將離翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游最遠(yuǎn)的20659 bp位定義為+1,與已報(bào)道ACSL1 m RNA序列(NM_001076085)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相比,我們將ACSL1基因m RNA序列的5'UTR在原有基礎(chǔ)上向前推進(jìn)7 bp。采用Real-time PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ACSL1基因在牛皮下脂肪組織、心臟、骨骼肌、肝臟組織中高豐度表達(dá),而在瘤胃、網(wǎng)胃以及肺組織中表達(dá)量很低,揭示該基因可能參與調(diào)控牛骨骼肌中脂肪酸的組成。(2)克隆得到牛ACSL1基因5'側(cè)翼序列1954 bp。啟動(dòng)子缺失片段的熒光素活性分析表明,ACSL1基因核心啟動(dòng)子區(qū)域位于-325~-140 bp,而且發(fā)現(xiàn)Cp G島位于核心啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)。其核心啟動(dòng)子區(qū)域序列與Gene Bank公布的人、小鼠、豬基因啟動(dòng)子序列高度相似。生物信息預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),ACSL1基因核心啟動(dòng)子區(qū)域存在E2F1、SP1、KLF15和E2F4等保守的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。另外,ACSL1基因啟動(dòng)子具有典型的真核生啟動(dòng)子元件,TATA-box位于-36位。(3)通過(guò)RNA干擾(RAN interfering,RNAi)實(shí)驗(yàn),分別共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p GL-325/+21和不同劑量的E2F1 si RNA、SP1 si RNA、KLF15 si RNA、E2F4 si RNA以及對(duì)照Control si RNA到C2C12細(xì)胞中。研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染不同劑量(1~9 pmol)的E2F1 si RNA使p GL-325/+21啟動(dòng)子活性下降了25%~62%;轉(zhuǎn)染不同劑量的SP1 si RNA使p GL-325/+21啟動(dòng)子活性下降了36%~56%;轉(zhuǎn)染不同劑量的KLF15 si RNA使p GL-325/+21啟動(dòng)子活性下降了20%~39%;轉(zhuǎn)染不同劑量的E2F4 si RNA使p GL-325/+21啟動(dòng)子活性下降了30%~45%,并且啟動(dòng)子活性降低均呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性(p0.01)。(4)通過(guò)定點(diǎn)突變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),確定了E2F1、SP1、KLF15和E2F4在維持ACSL1基因啟動(dòng)子活性中的作用。突變轉(zhuǎn)錄因子SP1結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子活性增加145%(p0.01);而突變E2F1、KLF15和E2F4轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)活性下降58%~71%(p0.01);聯(lián)合突變E2F1和KLF15轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),或聯(lián)合突變E2F1和E2F4轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),與單獨(dú)突變E2F1、KLF15和E2F4轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)相比,進(jìn)一步引起啟動(dòng)子活性下降。另外,體外EMSA證實(shí)E2F1、SP1、KLF15和E2F4轉(zhuǎn)錄因子能夠與牛ACSL1基因啟動(dòng)子中相應(yīng)的順式作用元件特異性結(jié)合。以上結(jié)果表明,E2F1( 197 to 181)、SP1( 165 to 149)、KLF15( 164 to 146)和E2F4( 157 to 141)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是維持牛ACSL1基因啟動(dòng)子基本轉(zhuǎn)錄活性必須的順式作用元件。本研究也為ACSL1基因調(diào)控牛骨骼肌中脂肪酸組成的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制提供新的科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:In order to clarify the molecular mechanism of ACSL1 gene and to improve the nutritive value of beef and to cultivate high quality beef cattle breeds . In addition , the ACSL1 gene promoter has a typical eukaryotic promoter element , TATA - box is located at -36 position . ( 3 ) The activity of pGL - 325 / + 21 promoter was decreased by 25 % 锝，

本文編號(hào)：2124788