發(fā)布時間：2018-07-14 12:21

【摘要】：由水稻黑條矮縮病毒(Riceblack-streaked dwarf virus，，RBSDV)引起的水稻黑條矮縮病(Rice black-streaked dwarf disease)是由灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)(SBPH)以持久性不經卵傳的方式傳播的一種惡性病毒病,該病可導致水稻矮化、抽穗結實困難,嚴重的影響了水稻的產量。發(fā)掘抗性基因,通過改良水稻自身防衛(wèi)系統(tǒng)以培育抗性品種是有效預防該病害的重要策略。之前的研究中我們以淮稻5號/烏殼(RBSDV抗性品種)后代分離群體為對象,利用基于簡化基因組深度測序技術(SLAF-seq)構建高密度遺傳連鎖圖譜和人工接種鑒定分析獲取表型數據的基礎上,精細定位出6個水稻黑條矮縮病的抗性QTL,本研究采用電子數據庫基因注釋、抗感材料基因篩查和轉基因功能驗證的方法對其中3個抗黑條矮縮病QTL(qRBSDV-6a、qRBSDV-6b和qRBSDV-6c)的進行研究,主要研究結果如下:1)本試驗綜合水稻全基因組測序數據庫、生物信息學和功能基因組學的方法,利用5個數據庫(COG、GO、KEGG、Swiss-Prot、nr)分子功能信息的基因測序報告,對水稻黑條矮縮病3個抗性QTL(qRBSD V-6a、qRBSDV-6b和qRBSDV-6c)進行初步篩選,根據目前已克隆的抗病毒基因的類型篩查出78個候選基因,包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,LRR受體蛋白激酶,轉錄調節(jié)因子等。2)分別克隆感病粳稻品種淮稻5號和抗病秈稻品種烏殼中的候選基因,通過測序對這78個基因的核苷酸和氨基酸的序列進行差異性的驗證分析,并對存在序列差異性的候選基因在NCBI和SMART等網站分析氨基酸的差異可能引起的功能變化,結果發(fā)現候選基因中有21個無核苷酸的差異,14個有核苷酸的差異但無氨基酸的差異,兩者的差異都存在但是突變不在蛋白功能區(qū)有18個,在淮稻5號或烏殼中多次設計引物仍擴不到正確的候選基因的有13個,核苷酸和氨基酸差異都存在且突變在蛋白功能區(qū)的有12個,包括蛋白激酶和蛋白受體,F-box結構域,Myb轉錄因子等。同時,為進一步驗證了這12個候選基因氨基酸突變的穩(wěn)定性,對后代F2代極抗和極感群體進行單株克隆測序,發(fā)現兩者之間不但親本與后代F2代基因序列存在一致性,而且F2代極抗和極感群體仍存在穩(wěn)定的氨基酸差異。3)對已驗證的候選基因進行轉基因載體的構建,經T4-DNA連接酶將目的基因連接到植物表達載體pCAMBIA1301上,并通過對重組質粒的抗性篩選、PCR檢測,證實成功構建了植物表達載體pCAMBIA 1301。為驗證目的基因在水稻中的功能,將12個候選基因轉入感病水稻植株淮稻5號,最后獲得8個轉基因水稻株系。對獲得的轉基因水稻植株,首先采用PCR對轉基因水稻植株(T0代)的選擇標記基因(潮霉素Hyg抗性)進行了檢測,結果發(fā)現攜帶潮霉素抗性基因的比率在84.8%到100%之間;對攜帶Hyg的水稻進行目的基因的PCR檢測,比率達100%。單株收取T0代轉基因水稻的T1代種子,對T2轉基因苗株系的T1代種子進行RBSDV的接毒實驗,結果顯示每株苗的RBSDV含量都較高,帶毒率在68.2%-93.3%之間,部分T1代種子的帶毒率低于感病品種淮稻5號,最后還要進一步通過表型分析進行驗證轉基因水稻的抗性。由于RBSDV同樣引起中國玉米粗縮病和小麥}尋

本文編號：2121628