發(fā)布時間：2018-07-09 14:50

  本文選題：Gcm2 + 甲狀旁腺�。� 參考：《第三軍醫(yī)大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景Gcm(glial cells missing)基因首先是在果蠅中被發(fā)現(xiàn)的。果蠅Gcm基因缺失,神經前體細胞向神經膠質細胞的分化發(fā)生障礙,在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了Gcm同源性基因Gcm1和Gcm2。Gcm1主要表達于胎盤迷路滋養(yǎng)層細胞,參與合體滋養(yǎng)層細胞分化和絨毛膜的形成;Gcm2是僅在甲狀旁腺細胞中有表達的一種轉錄因子。它在調節(jié)胚胎早期甲狀旁腺細胞的分化及胚胎后期甲狀旁腺細胞的存活中起著至關重要的作用。小鼠胚胎早期敲除Gcm2基因,可觀察到小鼠甲狀旁腺缺失。人類Gcm2基因的突變可以導致先天性家族性孤立性甲狀旁腺功能減退癥。研究表明,Gcm2在成體甲狀旁腺細胞中仍持續(xù)表達,這提示Gcm2基因除在甲狀旁腺胚胎發(fā)育進程中發(fā)揮決定性作用外,可能在成熟的甲狀旁腺細胞中仍具有重要功能。然而,關于Gcm2基因的研究目前主要關注其在胚胎發(fā)育早期階段的功能,以傳統(tǒng)的基因敲除技術在胚胎早期便敲除了Gcm2基因,無法進一步研究其在成體甲狀旁腺細胞中的功能。Cre/Lox P他莫昔芬可誘導性條件性基因敲除技術是近年來普遍運用的一種基因敲除方法。該技術將雌激素受體(estrogen receptor,ER)的配體結合區(qū)(ligand binding domain,LBD)與Cre重組酶進行融合,形成一種嵌合重組酶。該嵌合重組酶不能直接入核與Loxp位點相結合,只有在給予外源性他莫昔芬時,才能入核發(fā)揮重組作用。如此可實現(xiàn)基因敲除在時間上的把控。本研究利用Cre/Lox P敲除系統(tǒng),首次建立了他莫昔芬可誘導的Gcm2基因敲除小鼠模型,實現(xiàn)了Gcm2基因敲除在時間上的把控。在小鼠發(fā)育成熟后腹腔注射他莫昔芬誘導Gcm2基因的敲除,檢測Gcm2基因敲除后小鼠機體的鈣、磷代謝情況及甲狀旁腺細胞的增殖情況。以此初步探索Gcm2基因在成體小鼠甲狀旁腺細胞中的功能,為進一步探究甲狀旁腺功能異�；蛑委熜掳悬c提供實驗參考依據(jù)。研究方法1.通過基因型為Gcm2E2fl/+的F0代小鼠交配繁殖,篩選得到基因型為Gcm2E2fl/fl的F1代小鼠;將其與Cre-ER轉基因小鼠進行雜交,獲得基因型為Gcm2E2fl/+Cre-ER和Gcm2E2fl/+的F2代小鼠;將F2代小鼠進行自交或與F1代小鼠回交,獲得基因型為Gcm2E2fl/flCre-ER的可誘導性條件性基因敲除小鼠;2.6周齡小鼠于腹腔注射他莫昔芬誘導Gcm2基因敲除,連續(xù)打藥5天;3.采用PCR技術鑒定敲除小鼠基因型;4.采用蛋白質印跡法檢測甲狀旁腺Gcm2蛋白的表達;5.鈣磷測定試劑盒和ELISA檢測試劑盒分別檢測血清鈣、磷、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)及1,25(OH)2D3濃度變化;6.Ki-67免疫組化染色觀察甲狀旁腺細胞的增殖變化情況;7.Real-time PCR檢測甲狀旁腺和胸腺組織Gcm2、PTH及CaSR基因mRNA的表達;8.micro CT檢測骨代謝情況。實驗結果1.經三代繁育,獲得基因型為Gcm2E2fl/flCre-ER的可誘導的條件性基因敲除小鼠;2.他莫昔芬誘導后,PCR檢測甲狀旁腺組織Gcm2基因呈敲除型;3.與野生型和溶劑對照組相比,Gcm2敲除組小鼠甲狀旁腺Gcm2蛋白表達顯著下調(P值均0.05);4.Gcm2敲除組血磷濃度明顯升高(P值均0.05),血鈣和PTH濃度顯著降低(P值均0.05),血1,25(OH)2D濃度無明顯變化。5.Gcm2敲除后HE染色發(fā)現(xiàn),甲狀旁腺細胞形態(tài)無明顯變化;6.Ki-67免疫組化染色發(fā)現(xiàn),Gcm2敲除組甲狀旁腺細胞增殖增強(P值均0.05);7.甲狀旁腺中PTH和Ca SR的mRNA表達顯著下調(P值均0.05)。胸腺PTH mRNA的表達明顯上調(P值均0.05),而CaSR mRNA的表達無明顯差異;8.股骨ROI區(qū)域的骨體積(BV)、相對骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、厚度(Tb.Th)及骨密度(BMD)均明顯增加(P值均0.05)。結論1.他莫昔芬100 mg/kg連續(xù)注射5天可誘導成體小鼠Gcm2基因的敲除。2.成體小鼠Gcm2基因敲除后表現(xiàn)為甲狀旁腺功能減退癥;3.PTH和CaSR均位于Gcm2下游,成體小鼠Gcm2基因敲除后胸腺細胞可以代償性產生少量PTH;3.成體小鼠Gcm2基因敲除后,甲狀旁腺細胞形態(tài)沒有變化,發(fā)生了代償性增殖;
[Abstract]:In this study , Gcm 1 and Gcm2.Gcm 2 gene was used to knock out Gcm 2 gene in the early stage of embryo development . Results 1 . The expression of Gcm 2 gene was decreased significantly ( P value was 0.05 ) , and the expression of PTH mRNA in the Gcm2 knockout group was significantly lower than that of wild type and solvent control group ( P < 0.05 ) .
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R582

【參考文獻】

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本文編號：2109715