發(fā)布時(shí)間：2018-07-09 14:50

  本文選題：Gcm2 + 甲狀旁腺　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景Gcm(glial cells missing)基因首先是在果蠅中被發(fā)現(xiàn)的。果蠅Gcm基因缺失,神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化發(fā)生障礙,在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了Gcm同源性基因Gcm1和Gcm2。Gcm1主要表達(dá)于胎盤迷路滋養(yǎng)層細(xì)胞,參與合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分化和絨毛膜的形成;Gcm2是僅在甲狀旁腺細(xì)胞中有表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄因子。它在調(diào)節(jié)胚胎早期甲狀旁腺細(xì)胞的分化及胚胎后期甲狀旁腺細(xì)胞的存活中起著至關(guān)重要的作用。小鼠胚胎早期敲除Gcm2基因,可觀察到小鼠甲狀旁腺缺失。人類Gcm2基因的突變可以導(dǎo)致先天性家族性孤立性甲狀旁腺功能減退癥。研究表明,Gcm2在成體甲狀旁腺細(xì)胞中仍持續(xù)表達(dá),這提示Gcm2基因除在甲狀旁腺胚胎發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮決定性作用外,可能在成熟的甲狀旁腺細(xì)胞中仍具有重要功能。然而,關(guān)于Gcm2基因的研究目前主要關(guān)注其在胚胎發(fā)育早期階段的功能,以傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)在胚胎早期便敲除了Gcm2基因,無法進(jìn)一步研究其在成體甲狀旁腺細(xì)胞中的功能。Cre/Lox P他莫昔芬可誘導(dǎo)性條件性基因敲除技術(shù)是近年來普遍運(yùn)用的一種基因敲除方法。該技術(shù)將雌激素受體(estrogen receptor,ER)的配體結(jié)合區(qū)(ligand binding domain,LBD)與Cre重組酶進(jìn)行融合,形成一種嵌合重組酶。該嵌合重組酶不能直接入核與Loxp位點(diǎn)相結(jié)合,只有在給予外源性他莫昔芬時(shí),才能入核發(fā)揮重組作用。如此可實(shí)現(xiàn)基因敲除在時(shí)間上的把控。本研究利用Cre/Lox P敲除系統(tǒng),首次建立了他莫昔芬可誘導(dǎo)的Gcm2基因敲除小鼠模型,實(shí)現(xiàn)了Gcm2基因敲除在時(shí)間上的把控。在小鼠發(fā)育成熟后腹腔注射他莫昔芬誘導(dǎo)Gcm2基因的敲除,檢測(cè)Gcm2基因敲除后小鼠機(jī)體的鈣、磷代謝情況及甲狀旁腺細(xì)胞的增殖情況。以此初步探索Gcm2基因在成體小鼠甲狀旁腺細(xì)胞中的功能,為進(jìn)一步探究甲狀旁腺功能異�；蛑委熜掳悬c(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。研究方法1.通過基因型為Gcm2E2fl/+的F0代小鼠交配繁殖,篩選得到基因型為Gcm2E2fl/fl的F1代小鼠;將其與Cre-ER轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交,獲得基因型為Gcm2E2fl/+Cre-ER和Gcm2E2fl/+的F2代小鼠;將F2代小鼠進(jìn)行自交或與F1代小鼠回交,獲得基因型為Gcm2E2fl/flCre-ER的可誘導(dǎo)性條件性基因敲除小鼠;2.6周齡小鼠于腹腔注射他莫昔芬誘導(dǎo)Gcm2基因敲除,連續(xù)打藥5天;3.采用PCR技術(shù)鑒定敲除小鼠基因型;4.采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)甲狀旁腺Gcm2蛋白的表達(dá);5.鈣磷測(cè)定試劑盒和ELISA檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)血清鈣、磷、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)及1,25(OH)2D3濃度變化;6.Ki-67免疫組化染色觀察甲狀旁腺細(xì)胞的增殖變化情況;7.Real-time PCR檢測(cè)甲狀旁腺和胸腺組織Gcm2、PTH及CaSR基因mRNA的表達(dá);8.micro CT檢測(cè)骨代謝情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.經(jīng)三代繁育,獲得基因型為Gcm2E2fl/flCre-ER的可誘導(dǎo)的條件性基因敲除小鼠;2.他莫昔芬誘導(dǎo)后,PCR檢測(cè)甲狀旁腺組織Gcm2基因呈敲除型;3.與野生型和溶劑對(duì)照組相比,Gcm2敲除組小鼠甲狀旁腺Gcm2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P值均0.05);4.Gcm2敲除組血磷濃度明顯升高(P值均0.05),血鈣和PTH濃度顯著降低(P值均0.05),血1,25(OH)2D濃度無明顯變化。5.Gcm2敲除后HE染色發(fā)現(xiàn),甲狀旁腺細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;6.Ki-67免疫組化染色發(fā)現(xiàn),Gcm2敲除組甲狀旁腺細(xì)胞增殖增強(qiáng)(P值均0.05);7.甲狀旁腺中PTH和Ca SR的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P值均0.05)。胸腺PTH mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P值均0.05),而CaSR mRNA的表達(dá)無明顯差異;8.股骨ROI區(qū)域的骨體積(BV)、相對(duì)骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、厚度(Tb.Th)及骨密度(BMD)均明顯增加(P值均0.05)。結(jié)論1.他莫昔芬100 mg/kg連續(xù)注射5天可誘導(dǎo)成體小鼠Gcm2基因的敲除。2.成體小鼠Gcm2基因敲除后表現(xiàn)為甲狀旁腺功能減退癥;3.PTH和CaSR均位于Gcm2下游,成體小鼠Gcm2基因敲除后胸腺細(xì)胞可以代償性產(chǎn)生少量PTH;3.成體小鼠Gcm2基因敲除后,甲狀旁腺細(xì)胞形態(tài)沒有變化,發(fā)生了代償性增殖;
[Abstract]:In this study , Gcm 1 and Gcm2.Gcm 2 gene was used to knock out Gcm 2 gene in the early stage of embryo development . Results 1 . The expression of Gcm 2 gene was decreased significantly ( P value was 0.05 ) , and the expression of PTH mRNA in the Gcm2 knockout group was significantly lower than that of wild type and solvent control group ( P < 0.05 ) .
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R582

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 朱國(guó)華;鄒賢;宋智明;孫志強(qiáng);王丹鳳;;甲狀腺不同手術(shù)方式對(duì)甲狀旁腺功能的影響[J];中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展;2014年05期

2 翟博,武林楓,胡鳳麗,劉穎新;大鼠甲狀旁腺功能低下模型建立方法的比較研究[J];中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展;2005年04期

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4 吳壯宏;陳國(guó)銳;詹世光;林勇杰;劉奕山;黃燦之;周漢城;任超玲;;如何制備大鼠甲狀旁腺功能低下癥模型[J];中華器官移植雜志;1989年03期

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本文編號(hào)：2109715