本文選題：雙鏈重組9型腺相關(guān)病毒 + Frz�。� 參考：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:以雙鏈重組AAV9(double strand AAV9,ds AAV9)型腺相關(guān)病毒為載體介導(dǎo)的Frz A基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞炎癥損傷模型,觀察是否能抑制心肌細(xì)胞Wnt通路表達(dá)活性,從而減輕心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞存活。方法:利用TNF-α刺激H9c2心肌細(xì)胞建立心肌細(xì)胞炎癥損傷模型,模擬體內(nèi)心肌缺血狀態(tài),MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性及Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率,確定TNF-α最佳濃度。ds AAV9介導(dǎo)Frz A基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Wnt通路關(guān)鍵分子蛋白的表達(dá),RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Wnt通路關(guān)鍵分子m RNA的表達(dá)。Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果:(1)免疫熒光結(jié)果顯示心肌細(xì)胞的純度可達(dá)到98%以上。(2)MTT與Annexin V-FITC/P I雙染法結(jié)果顯示TNF-α濃度對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響是以劑量依賴的方式,隨著TNF-α的濃度增加,心肌細(xì)胞活性降低,細(xì)胞凋亡率增高,應(yīng)選擇濃度50μg/L的TNF-α來建立心肌細(xì)胞炎癥損傷模型。(3)Western blot及RT-PCR結(jié)果均顯示TNF-α可有效激活Wnt信號(hào)通路,且Frz A基因轉(zhuǎn)染可抑制Wnt信號(hào)通路的活性。(4)Western blot及Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示,TNF-α激活Wnt信號(hào)通路后,細(xì)胞凋亡增多。而ds AAV9介導(dǎo)Frz A基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可有效減輕TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,并且這種抗凋亡作用有可能正是通過抑制Wnt信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論:CMV啟動(dòng)子介導(dǎo)的ds AAV9載體可高效的轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,TNF-α刺激體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞可建立心肌細(xì)胞炎癥損傷模型,模擬體內(nèi)心力衰竭狀態(tài),激活Wnt信號(hào)通路,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。Ds AAV9介導(dǎo)Frz A基因轉(zhuǎn)染可抑制心肌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的表達(dá)活性,可有效減輕心肌細(xì)胞的凋亡。
[Abstract]:Aim: to investigate whether the expression of Wnt pathway in cardiomyocytes can be inhibited and the apoptosis of cardiomyocytes can be alleviated by transfection of Frz A gene into cardiomyocytes with double-stranded recombinant AAV9 (double strand AAV9ds AAV9 adeno-associated virus as a vector. Promote cell survival. Methods: the myocardial inflammatory injury model was established by TNF- 偽 stimulation of H9c2 cardiomyocytes. The cell activity was detected by MTT assay and the apoptosis rate of cardiomyocytes was detected by Annexin V-FITC / Pi double staining. Determination of the optimal concentration of TNF- 偽 .DS AAV9 mediated Frz-A gene transfection into cardiomyocytes Western blot detection of Wnt pathway key molecule protein expression in each group; RT-PCR detection of Wnt pathway key molecule mRNA expression; Western blot detection of apoptosis in each group of cells The expression of related protein was detected by Annexin V-FITC / Pi double staining. Results: (1) Immunofluorescence showed that the purity of cardiomyocytes was over 98%. (2) the results of MTT and Annexin V-FITC / P I double staining showed that the effect of TNF- 偽 concentration on cardiomyocyte activity was dose-dependent. With the increase of TNF- 偽 concentration, cardiomyocyte activity decreased. TNF- 偽 concentration of 50 渭 g / L should be selected to establish myocardial inflammatory injury model. (3) Western blot and RT-PCR results showed that TNF- 偽 could effectively activate Wnt signaling pathway. FrzA gene transfection inhibited the activity of Wnt signaling pathway. (4) Western blot and Annexin V-FITC / Pi double staining showed that TNF- 偽 activated Wnt signaling pathway and apoptosis increased. DS AAV9 mediated Frz A gene transduction can effectively attenuate the apoptosis induced by TNF- 偽, and this anti-apoptosis effect may be achieved by inhibiting the Wnt signaling pathway. Conclusion DS AAV9 vector mediated by 1: CMV promoter can efficiently transfect TNF- 偽 into cultured cardiomyocytes to establish myocardial inflammatory injury model, simulate heart failure in vivo and activate Wnt signaling pathway. Inducing cardiomyocyte apoptosis. DS-AAV9 mediated FrzA gene transfection can inhibit the expression of Wnt signal pathway and attenuate the apoptosis of cardiomyocytes.
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2106319