發(fā)布時(shí)間：2018-07-06 07:08

  本文選題：馬鈴薯 + 糖苷生物堿��； 參考：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：糖苷生物堿(GAs)具有抑制病原微生物侵襲、拒避昆蟲采食、抗?jié)B透脅迫和化感效應(yīng),但馬鈴薯(Solanum tuberosum)塊莖中過量積累會影響到食用風(fēng)味和安全性。因此,通過分子調(diào)控手段特異性地降低塊莖中GAs積累,對于提高馬鈴薯抗逆性并滿足食用安全性至關(guān)重要。GAs合成途徑的末端酶為茄啶-糖基轉(zhuǎn)移酶(Solanidine glycosyltransferase,Sgt)家族的三個成員(Sgt1、Sgt2和Sgt3),它們的表達(dá)水平和活性影響到GAs的合成速率和水平。目前,對于馬鈴薯塊莖GAs合成代謝調(diào)控,僅見到對于Sgt家族成員其中之一的抑制研究,但是對Sgt家族成員的單基因?qū)嵤┱{(diào)控,很難有效降低塊莖中GAs的積累。為此,本研究采用RNAi技術(shù),以GAs合成代謝途徑三個末端酶基因?yàn)榘袠?biāo),構(gòu)建塊莖特異性啟動子Patatin驅(qū)動的RNAi載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化2個馬鈴薯基因型,用以鑒定特異抑制三個Sgt基因家族對于塊莖中GAs積累的影響,為采用分子調(diào)控技術(shù)培育塊莖GAs含量低的馬鈴薯種質(zhì)提供理論依據(jù)和參考。目前研究取得了如下結(jié)果:1.采用生物信息學(xué)方法,對GAs合成途徑3個末端酶基因進(jìn)行尋靶,找到了敏感靶標(biāo)區(qū)段,采用重疊PCR技術(shù)將3個基因敏感片段融合,得到正向片段F和反向片段R。然后將二者分別插入載體pHANNIBAL內(nèi)含子(intron)兩側(cè),獲得重組質(zhì)粒pHAI-FR,再使用Patatin啟動子替換pHANNIBAL所攜帶的CaMV 35s啟動子;最后將“Patatin P-正向融合片段-pdk-反向融合片段-OCS-ter”整體酶切后插入載體pCEPSPS,最終得到含融合基因ABC反向重復(fù)序列的植物表達(dá)載體pCEI-PFR,并利用凍融轉(zhuǎn)化法將所獲得的植物表達(dá)載體整合到農(nóng)桿菌LBA4404中;2.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化2個馬鈴薯基因型(莊薯3號和費(fèi)烏瑞它),使用農(nóng)桿菌菌液對其無腋芽莖段進(jìn)行侵染,經(jīng)過草甘膦篩選和PCR檢測,得到了10株(莊薯3號)和11株(費(fèi)烏瑞它)轉(zhuǎn)融合基因反向重復(fù)片段表達(dá)呈陽性的植株,陽性植株率為0.50%-0.90%(莊薯3號)和0.75%-0.90%(費(fèi)烏瑞它);3.使用RT-qPCR技術(shù)測定轉(zhuǎn)化植株內(nèi)各基因的表達(dá)進(jìn)行檢測,結(jié)果證實(shí),轉(zhuǎn)化植株塊莖內(nèi)三個Sgt基因的表達(dá)量分別降低了32%-60%(Sgt1)、29%-55%(Sgt2)和25%-66%(Sgt3),而草甘膦基因的表達(dá)量增加了48%-135%;但葉片中Sgts基因的表達(dá)量未有顯著變化;4.利用分光光度法對馬鈴薯GAs含量進(jìn)行了測定。與野生馬鈴薯相對比,轉(zhuǎn)基因植株地下部分的GAs含量降低了41%-59%(莊薯3號)和36%-62%(費(fèi)烏瑞它);而地上部分的GAs含量并無顯著減少。
[Abstract]:Glycoside alkaloids (gas) can inhibit the invasion of pathogenic microorganisms, avoid insect feeding, resist osmotic stress and allelopathy, but excessive accumulation of potato (Solanum tuberosum) tubers will affect the food flavor and safety. Therefore, the accumulation of gas in tubers was specifically reduced by means of molecular regulation. The terminal enzyme of Solanidine glycosyltransferase (Solanidine glycosyltransferase Sgt) family (Sgt1, Sgt2 and Sgt3) is the terminal enzyme of potato biosynthesis pathway. The expression and activity of these enzymes affect the synthesis rate and level of gas. At present, only one of the Sgt family members is inhibited by the regulation of the synthesis and metabolism of potato tubers, but it is difficult to effectively reduce the accumulation of gas in the tubers by regulating the single gene of the Sgt family members. In this study, RNAi was used to construct tuber specific promoter Patatin driven RNAi vector, and two potato genotypes were transformed by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. It was used to identify the effects of specific inhibition of three Sgt gene families on the accumulation of gas in tubers, and to provide theoretical basis and reference for the cultivation of potato germplasm with low gas content in tubers by molecular control techniques. The results of the present study are as follows: 1. The three terminal enzyme genes of gas synthesis pathway were targeted by bioinformatics, and the sensitive target region was found. The positive fragment F and the reverse fragment R3 were fused by overlapping PCR technique. Then the recombinant plasmid pHAI-FRwas obtained by inserting them into the (intron) of the intron of pH ANNIBAL, and the CaMV 35s promoter carried by pH ANNIBAL was replaced by the patatin promoter. Finally, "Patatin P- forward fusion fragment-pdk- reverse fusion fragment-OCS-ter" was digested and inserted into the vector pCEPSPS.The plant expression vector pCEI-PFRcontaining ABC reverse repeat sequence of fusion gene was obtained, and the plant was obtained by freeze-thaw transformation. The expression vector was integrated into Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Two potato genotypes (Zhuangshu 3 and Fiurita) were transformed by Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens) and infected with Agrobacterium tumefaciens. Ten (Zhuangshu 3) and 11 (Fiurita) transgenic plants with positive reverse repeat expression of fusion gene were obtained. The positive rates were 0.50-0.90% (Zhuangshu 3) and 0.75 -0.90% (Fiurita). RT-qPCR technique was used to detect the expression of the genes in the transformed plants. The expression of three SGT genes in tubers of transformed plants decreased by 32-60% (SgT1) 29-55% (Sgt2) and 25-66% (Sgt3), while glyphosate gene expression increased by 48-135%, but there was no significant change in Sgts gene expression in leaves. The content of gas in potato was determined by spectrophotometry. Compared with wild potato, gas content in underground parts of transgenic plants was decreased by 41-59% (Zhuangshu No. 3) and 36-62% (Fiurita), but no significant decrease was found in aboveground parts.
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S532

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本文編號：2101915