發(fā)布時(shí)間：2018-07-05 08:40

  本文選題：維吉尼亞鏈霉菌 + 基因組測(cè)序　； 參考：《安徽大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：維吉尼亞鏈霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14)是一株革蘭氏陽性菌,能夠高效轉(zhuǎn)化及降解皮質(zhì)醇、膽固醇、黃銅和孕酮等甾醇類化合物,是本實(shí)驗(yàn)室在制藥廠周圍的污泥中分離并純化的一株放線菌。在先前的抗生素抗性篩選研究中,發(fā)現(xiàn)IBL14菌株能夠在含較高濃度青霉素的培養(yǎng)基中生長,而青霉素一般為真菌中的霉菌所產(chǎn)生。為了揭示這種現(xiàn)象,本實(shí)驗(yàn)室通過Illumina Hiseq2000平臺(tái)測(cè)序?qū)ζ淙蚪M進(jìn)行了測(cè)序,并對(duì)測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、組裝和評(píng)估,然后依賴數(shù)據(jù)庫GO、KEGG和Swiss-Prot,以及NR和COG對(duì)獲得的ORF進(jìn)行基因功能通用注釋,最終篩選出7個(gè)可能與青霉素代謝相關(guān)的酶基因,分別為異青霉素N異構(gòu)酶(sviipe)、青霉素酰胺酶(svipam1和svipam2)和β-內(nèi)酰胺酶(svibla1、svibla2、svibla3、svibla4)。CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物長期進(jìn)化過程中形成的一種免疫防御機(jī)制,廣泛存在于古細(xì)菌和真細(xì)菌中。CRISPR位點(diǎn)是由一系列高度保守的正向重復(fù)序列(repeats)和間隔序列(spacer)排列組成的多段R-S結(jié)構(gòu),其位點(diǎn)附近存在一系列 CRISPR 相關(guān)蛋白(CRISPR association protein,cas protein),依據(jù) Cas 蛋白的差異,將其分為兩類六型。雖然含有CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物近2000種,但能起到基因編輯作用的僅有CRISPR-Cas9和V型Cpf1。CRISPR-Cas系統(tǒng)作為一種新的基因編輯工具,它克服了傳統(tǒng)技術(shù)的一些缺點(diǎn),如操作繁瑣、耗時(shí)長、成本高等,使得基因編輯更加精準(zhǔn)、高效、快速。IBL14菌株全基因組組分分析表明,其染色體中存在CRISPR系統(tǒng)。Cas蛋白預(yù)測(cè)和比對(duì)發(fā)現(xiàn),其染色體上含有Cas7、Cas5、Cas3、Cas4、Cas1和Cas2,并且這些蛋白位于同一個(gè)操縱子上。其中,Cas3具有DNA剪切作用。因此,本實(shí)驗(yàn)室將其命名為I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)。本論文首次應(yīng)用IBL14菌株自身I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)青霉素代謝相關(guān)酶基因進(jìn)行編輯,實(shí)現(xiàn)了異青霉素N異構(gòu)酶(sviipe)基因的插入;青霉素酰胺酶(svipam1 和 svipam2)和β-內(nèi)酰胺酶(svibla1、sviblaa2、svibla3、svibla4)基因的單敲除;青霉素酰胺酶(svipaml)和異青霉素N異構(gòu)酶(sviipe)以及青霉素酰胺酶(svipaml)和β-內(nèi)酰胺酶(sviblal)基因的雙敲除。編輯中,選擇了不同的PAM位點(diǎn)、template和repeat序列。其中,svipam的敲除結(jié)果表明,PAM位點(diǎn)為ttc的敲除效率較tcc稍高;svibla1的敲除結(jié)果表明,偏長的template敲除效率較短的template敲除效率高,但template短至400 bp同樣能實(shí)現(xiàn)基因敲除;而CRISPR1和CRISPR2的repeat序列則無明顯差異。然后,對(duì)青霉素代謝相關(guān)酶基因敲除后的菌株進(jìn)行初步的青霉素抗性檢測(cè)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證基因敲除的正確性,同時(shí)初步驗(yàn)證內(nèi)酰胺酶基因的功能。在具體實(shí)施過程中,僅需要進(jìn)行編輯模板片段(editing templets)和靶向基因片段(target constructs)的設(shè)計(jì),構(gòu)建出含有向?qū)NA(single guide RNA)和基因編輯模板的敲除質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到IBL14原生質(zhì)體中,篩選得到敲除后的重組子,對(duì)重組子染色體進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測(cè)序分析即可。該方法操作簡單、耗時(shí)短、效率高,不僅為基因編輯提供了一種新的方向,同時(shí)也為基因功能鑒定提供了新的思路和方法。
[Abstract]:In the previous antibiotic resistance screening study , it was found that the IBL14 strain was able to grow in the medium containing higher concentration of penicillin , and penicillin was generally produced by the mold . In order to reveal the phenomenon , we screened seven enzyme genes which could be related to penicillin metabolism , including penicillin N isomerase ( svibla1 ) , penicillin acylase ( svipam1 and svipam2 ) and 尾 - lactamase ( svibla1 , svibla2 , svibla3 , svibla4 ) . The CRISPR - PCR system is a kind of immune defense mechanism formed in the process of long - term evolution of prokaryotic organism . The CRISPR locus is composed of a series of highly conserved positive repeat sequences ( CRISPR - Cas9 ) and spacer ( spacer ) . The method is simple in operation , short in time consumption and high in efficiency , not only provides a new direction for gene editing , but also provides a new idea and method for gene function identification .
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王佩,李玉珍;β-內(nèi)酰胺酶—細(xì)菌耐藥性機(jī)制之一[J];首都醫(yī)藥;2000年10期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李志陣;維吉尼亞鏈霉菌IBL14中細(xì)胞色素P450的鑒定與功能分析[D];安徽大學(xué);2012年

，

本文編號(hào)：2099630