本文選題：維吉尼亞鏈霉菌 + 基因組測序�。� 參考：《安徽大學》2017年碩士論文

【摘要】：維吉尼亞鏈霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14)是一株革蘭氏陽性菌,能夠高效轉(zhuǎn)化及降解皮質(zhì)醇、膽固醇、黃銅和孕酮等甾醇類化合物,是本實驗室在制藥廠周圍的污泥中分離并純化的一株放線菌。在先前的抗生素抗性篩選研究中,發(fā)現(xiàn)IBL14菌株能夠在含較高濃度青霉素的培養(yǎng)基中生長,而青霉素一般為真菌中的霉菌所產(chǎn)生。為了揭示這種現(xiàn)象,本實驗室通過Illumina Hiseq2000平臺測序?qū)ζ淙蚪M進行了測序,并對測序得到的數(shù)據(jù)進行過濾、組裝和評估,然后依賴數(shù)據(jù)庫GO、KEGG和Swiss-Prot,以及NR和COG對獲得的ORF進行基因功能通用注釋,最終篩選出7個可能與青霉素代謝相關的酶基因,分別為異青霉素N異構酶(sviipe)、青霉素酰胺酶(svipam1和svipam2)和β-內(nèi)酰胺酶(svibla1、svibla2、svibla3、svibla4)。CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物長期進化過程中形成的一種免疫防御機制,廣泛存在于古細菌和真細菌中。CRISPR位點是由一系列高度保守的正向重復序列(repeats)和間隔序列(spacer)排列組成的多段R-S結構,其位點附近存在一系列 CRISPR 相關蛋白(CRISPR association protein,cas protein),依據(jù) Cas 蛋白的差異,將其分為兩類六型。雖然含有CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物近2000種,但能起到基因編輯作用的僅有CRISPR-Cas9和V型Cpf1。CRISPR-Cas系統(tǒng)作為一種新的基因編輯工具,它克服了傳統(tǒng)技術的一些缺點,如操作繁瑣、耗時長、成本高等,使得基因編輯更加精準、高效、快速。IBL14菌株全基因組組分分析表明,其染色體中存在CRISPR系統(tǒng)。Cas蛋白預測和比對發(fā)現(xiàn),其染色體上含有Cas7、Cas5、Cas3、Cas4、Cas1和Cas2,并且這些蛋白位于同一個操縱子上。其中,Cas3具有DNA剪切作用。因此,本實驗室將其命名為I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)。本論文首次應用IBL14菌株自身I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)對青霉素代謝相關酶基因進行編輯,實現(xiàn)了異青霉素N異構酶(sviipe)基因的插入;青霉素酰胺酶(svipam1 和 svipam2)和β-內(nèi)酰胺酶(svibla1、sviblaa2、svibla3、svibla4)基因的單敲除;青霉素酰胺酶(svipaml)和異青霉素N異構酶(sviipe)以及青霉素酰胺酶(svipaml)和β-內(nèi)酰胺酶(sviblal)基因的雙敲除。編輯中,選擇了不同的PAM位點、template和repeat序列。其中,svipam的敲除結果表明,PAM位點為ttc的敲除效率較tcc稍高;svibla1的敲除結果表明,偏長的template敲除效率較短的template敲除效率高,但template短至400 bp同樣能實現(xiàn)基因敲除;而CRISPR1和CRISPR2的repeat序列則無明顯差異。然后,對青霉素代謝相關酶基因敲除后的菌株進行初步的青霉素抗性檢測實驗,進一步驗證基因敲除的正確性,同時初步驗證內(nèi)酰胺酶基因的功能。在具體實施過程中,僅需要進行編輯模板片段(editing templets)和靶向基因片段(target constructs)的設計,構建出含有向?qū)NA(single guide RNA)和基因編輯模板的敲除質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到IBL14原生質(zhì)體中,篩選得到敲除后的重組子,對重組子染色體進行PCR擴增,再進行PCR產(chǎn)物的測序分析即可。該方法操作簡單、耗時短、效率高,不僅為基因編輯提供了一種新的方向,同時也為基因功能鑒定提供了新的思路和方法。
[Abstract]:In the previous antibiotic resistance screening study , it was found that the IBL14 strain was able to grow in the medium containing higher concentration of penicillin , and penicillin was generally produced by the mold . In order to reveal the phenomenon , we screened seven enzyme genes which could be related to penicillin metabolism , including penicillin N isomerase ( svibla1 ) , penicillin acylase ( svipam1 and svipam2 ) and 尾 - lactamase ( svibla1 , svibla2 , svibla3 , svibla4 ) . The CRISPR - PCR system is a kind of immune defense mechanism formed in the process of long - term evolution of prokaryotic organism . The CRISPR locus is composed of a series of highly conserved positive repeat sequences ( CRISPR - Cas9 ) and spacer ( spacer ) . The method is simple in operation , short in time consumption and high in efficiency , not only provides a new direction for gene editing , but also provides a new idea and method for gene function identification .
【學位授予單位】：安徽大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 王佩,李玉珍;β-內(nèi)酰胺酶—細菌耐藥性機制之一[J];首都醫(yī)藥;2000年10期

相關碩士學位論文 前1條

1 李志陣;維吉尼亞鏈霉菌IBL14中細胞色素P450的鑒定與功能分析[D];安徽大學;2012年

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本文編號：2099630