本文選題：基因治療 + 陽離子聚合物基因載體　； 參考：《北京化工大學》2016年博士論文

【摘要】：基因治療指將核酸分子作為藥物遞送進入患者細胞,對疾病的基因表達進行調(diào)控(目標基因的表達或沉默)以治療疾病。作為全新治療途徑,基因治療在重大疾病的治療中發(fā)揮著舉足輕重的作用,但其研究現(xiàn)狀是受限于缺乏安全且高效率的基因載體。與高轉(zhuǎn)染效率、但安全性差的病毒類載體相比,陽離子聚合物為主要代表的非病毒類載體具有一些顯著優(yōu)點,例如安全性高(低免疫原性),可以大規(guī)模生產(chǎn)和聚合物設計的靈活多樣性。因此,開發(fā)新型陽離子聚合物基因載體材料一直吸引著人們強烈的研究興趣。近年來,原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)和超分子組裝被廣泛應用于生物醫(yī)用高分子材料的制備。生物相容性多糖(包括殼聚糖,葡聚糖,環(huán)糊精等)的功能化為新型基因載體材料的設計提供了多樣化的途徑。由于具有密集的分子結(jié)構(gòu)且保持適度的分子柔韌性這一優(yōu)點,星狀陽離子聚合物在非病毒基因載體研究中引起了廣泛的研究興趣。第二章中,利用ATRP制備了由不帶電的p-環(huán)糊精核、二硫鍵連接低分子量陽離子側(cè)鏈組成的可剪切星狀聚合物載體(CD-SS-PGEA)。首先,在p-環(huán)糊精上引入二硫鍵連接的ATRP引發(fā)位點;隨后,利用ATRP制備了聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)側(cè)鏈,并利用開環(huán)反應制備了PGMA的乙醇胺開環(huán)產(chǎn)物——具有豐富不帶電羥基和可質(zhì)子化仲胺基團的陽離子聚合物(PGEA)。在細胞內(nèi)還原性酶作用下,二硫鍵連接的PGEA臂可以從環(huán)糊精核上斷裂、解離下來。這種可剪切的星狀聚合物載體在不同細胞系中表現(xiàn)出良好的質(zhì)粒DNA絡合能力,低毒性和高轉(zhuǎn)染效率�；诜枪矁r鍵相互作用組裝形成的超分子聚合物,廣泛應用于基因載體的臨床前研究和臨床試驗,優(yōu)點在于：其合適的結(jié)合強度非常有利于功能分子遞送,并且簡便的自組裝過程有利于載體的簡便制備和結(jié)構(gòu)、功能優(yōu)化。β-環(huán)糊精主體分子和金剛烷客體分子之間的主客體組裝是一種經(jīng)典的超分子組裝體系,過程非常簡便,且已經(jīng)被充分證實和應用。第三章中,利用主客體組裝手段,組裝環(huán)糊精為核、PGEA為側(cè)鏈的星狀聚合物(CD-PGEA)和金剛烷分子修飾的線性PGEA合成了陽離子聚合物為骨架的超分子梳狀結(jié)構(gòu)載體(1-PGEA-Ad/CD-PGEA),是一種以非共價鍵連接的星狀聚合物為側(cè)鏈的獨特梳狀結(jié)構(gòu)——與組裝前星狀CD-PGEA和線性1-PGEA相比,1-PGEA-Ad/CD-PGEA顯示出更好的DNA絡合能力。同時,超分子梳狀聚合物載體具有和星狀、線性載體類似的低毒性,顯著提高的轉(zhuǎn)染效率。設計不同的骨架和聚合物側(cè)鏈、并引入可細胞內(nèi)剪切的二硫鍵,可以進一步證明超分子梳狀聚合物的新穎結(jié)構(gòu)在基因遞送中的優(yōu)勢,并探索轉(zhuǎn)染效率提高的內(nèi)在機理。第四章中,組裝環(huán)糊精為核、二硫鍵連接聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)側(cè)鏈的可剪切星狀陽離子聚合物(CD-SS-pDM)和二硫鍵連接的金剛烷修飾的葡聚糖(Dex-SS-Ad),合成了可剪切的超分子梳狀聚合物載體(Dex-SS-Ad/CD-SS-pDM);同時,制備無二硫鍵的對照組：將非剪切的星狀聚合物與金剛烷直接修飾的葡聚糖組裝,制備非剪切的超分子梳狀載體Dex-Ad/CD-pDM。與組裝前載體相比,兩種葡聚糖骨架的超分子梳狀載體顯示出類似的低細胞毒性,但轉(zhuǎn)染效率顯著提高,原因在于超分子梳狀載體具有顯著提高的細胞內(nèi)吞效率。由于引入刺激響應性的二硫鍵,可剪切的超分子梳狀載體轉(zhuǎn)染效率明顯高于非剪切的對照組,并且體外實驗證明前者介導的自殺基因治療系統(tǒng)具有優(yōu)異的抗腫瘤性能。在陽離子聚合物中引入聚甲基丙烯酸聚乙二醇(乙醚)酯(PPEGEEMA)可以提高轉(zhuǎn)染性能。然而,在陽離子聚合物中更合適地引入PPEGEEMA的方法需要進一步設計,PPEGEEMA提高轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)在機理也需要進一步研究。第五章中,組裝不同分子量可剪切的環(huán)糊精為核星狀陽離子聚合物(CD-SS-pDM)和金剛烷為端基線性PPEGEEMA,合成了一系列可剪切的超分子嵌段聚合物載體(CD-SS-pDM/Ad-pPEG),是一種在陽離子聚合物中更合適地引入PPEGEEMA的方法。與星狀載體相比,引入PPEGEEMA未降低CD-SS-pDM/Ad-pPEG載體的DNA絡合能力和二硫鍵的細胞內(nèi)可剪切性,同時降低了毒性、顯著地提高了轉(zhuǎn)染效率。進一步的無血清條件下細胞轉(zhuǎn)染、細胞內(nèi)吞以及動物體內(nèi)基因治療實驗證明PPEGEEMA的關鍵作用在于抑制蛋白非特異性吸附、提高血清中穩(wěn)定性,進一步提高內(nèi)吞效率。綜上所述,本論文利用ATRP和超分子組裝兩大合成方法,選擇環(huán)糊精作為基質(zhì)設計了多種類型的新穎結(jié)構(gòu)的聚合物。本論文通過ATRP和超分子組裝兩大合成方法,構(gòu)建了一系列基于環(huán)糊精的新穎結(jié)構(gòu)陽離子聚合物載體,體外細胞和體內(nèi)動物實驗證明了載體材料的高性能。這一系列高性能陽離子聚合物基因載體,對新型基因載體材料的構(gòu)建和環(huán)糊精為基質(zhì)聚合物的更廣泛應用均具有重要意義。
[Abstract]:Gene therapy refers to the delivery of nucleic acid molecules as drugs into the patient's cell, regulating the gene expression of the disease (the expression or silence of the target gene) to treat the disease. As a new therapeutic approach, gene therapy plays an important role in the treatment of major diseases, but its research status is limited to the lack of safety and efficiency. Compared with high transfection efficiency and poor safety viral vectors, cationic polymers have some significant advantages, such as high safety (low immunogenicity), and flexible diversity in mass production and polymer design. Therefore, a new type of cationic polymer gene is developed. In recent years, atomic transfer radical polymerization (ATRP) and supramolecular assembly have been widely used in the preparation of biomedical polymer materials. The functionalization of biocompatible polysaccharides, including chitosan, dextran, cyclodextrin, and so on, has provided a variety of design for the design of new gene carrier materials. Due to the advantages of dense molecular structure and moderate molecular flexibility, stellate cationic polymers have attracted extensive interest in the study of non viral gene carriers. In the second chapter, a shear star consisting of an uncharged p- cyclodextrin nucleus and a two sulfur bond connected to a low molecular weight cation side chain was prepared by ATRP. CD-SS-PGEA. First, the ATRP initiation site was introduced on p- cyclodextrin with two sulfur bonds. Then, the side chain of polyglycidyl methacrylate (PGMA) was prepared by ATRP, and the open ring product of the ethanolamine was prepared by the ring opening reaction - a cation with rich non charged hydroxyl and protonated secondary amine groups. Polymer (PGEA). Under the action of intracellular reductive enzymes, the two sulfur bond linked PGEA arm can be broken from the cyclodextrin nucleus and dissociated. This shear star polymer carrier shows good plasmid DNA complexation, low toxicity and high transfection efficiency in different cell lines. Subpolymers, widely used in preclinical and clinical trials of gene carriers, have the advantage that the appropriate binding strength is very beneficial to functional molecular delivery, and the simple self-assembly process is beneficial to the simple preparation and structure of the carrier and the function optimization. The host and guest group between the beta cyclodextrin host molecules and the adamantane guest molecules. The assembly is a classic supramolecular assembly system. The process is very simple and has been fully proved and applied. In the third chapter, the assembly of host and guest assembly means the assembly of cyclodextrin as the core, the PGEA as the side chain star polymer (CD-PGEA) and the linear PGEA modified by the amantadine molecule into the supramolecular comb structure of the cationic polymer as the skeleton. Body (1-PGEA-Ad/CD-PGEA) is a unique comb like structure of a star shaped polymer connected by a non covalent bond. Compared with the pre assembled stellate CD-PGEA and linear 1-PGEA, 1-PGEA-Ad/CD-PGEA shows a better DNA complexing ability. At the same time, the supramolecular comb polymer carrier has a similar low toxicity to the star shaped and linear vector. High transfection efficiency. The design of different skeleton and polymer side chains and the introduction of two sulfur bonds with intracellular shear can further prove the advantages of the novel structure of the supramolecular comb polymer in gene delivery and explore the intrinsic mechanism of the enhancement of transfection efficiency. In the fourth chapter, the group is packed with cyclodextrin as the core, and the two sulfur bond connects polymethacrylic acid N. N- two methylamino ethyl (PDMAEMA) side chain, the shear star shaped cationic polymer (CD-SS-pDM) and the two sulfur bond linked adamantane modified glucan (Dex-SS-Ad), synthesized a shear supramolecular comb polymer carrier (Dex-SS-Ad/CD-SS-pDM); at the same time, a control group without two sulfur bonds was prepared: the non shear star polymer and the adamantane Directly modified glucan assembly, the preparation of the non shear supramolecular comb carrier Dex-Ad/CD-pDM. compared with the pre assembled carrier, the two glucan skeleton supramolecular comb carriers showed similar low cytotoxicity, but the transfection efficiency was significantly improved because the supramolecular comb carrier had a significant increase in the endocytosis efficiency. The transfection efficiency of the two sulfur bond with irritation responsiveness, the transfection efficiency of the shear supramolecular comb carrier is significantly higher than that of the non shear control group, and in vitro experiments have proved that the former has excellent anti-tumor performance. The introduction of polymethacrylic acid polyethylene glycol (ether) ester (PPEGEEMA) in cationic polymers can be improved. Transfection performance. However, the more appropriate introduction of PPEGEEMA in cationic polymers needs further design. The internal mechanism of PPEGEEMA to improve transfection efficiency also needs further study. In the fifth chapter, the assembly of cyclodextrins with different molecular weights is nuclear star cationic polymerization (CD-SS-pDM) and adamantane as the end group linear PPEGEEMA, A series of shear supramolecular block polymer carriers (CD-SS-pDM/Ad-pPEG) is synthesized, which is a more suitable method for introducing PPEGEEMA in cationic polymers. Compared with stellate carriers, the introduction of PPEGEEMA does not reduce the DNA complexation capacity of the CD-SS-pDM/Ad-pPEG carrier and the intracellular cleavage of the two sulfur bond, and reduces the toxicity. The transfection efficiency is improved. Further serum-free cell transfection, endocytosis and animal gene therapy experiments show that the key role of PPEGEEMA is to inhibit non specific adsorption of protein, improve the stability of serum, and further improve endocytosis efficiency. In this paper, two combinations of ATRP and supramolecular assembly are used in this paper. A series of novel structural polymers were designed by cyclodextrin as matrix. In this paper, a series of novel structural cationic polymer carriers based on cyclodextrin were constructed by two synthetic methods of ATRP and supramolecular assembly. In vitro and in vivo animal experiments proved the high performance of the carrier materials. The performance of cationic polymer gene carriers is of great significance for the construction of new gene carrier materials and the wider application of cyclodextrins as matrix polymers.
【學位授予單位】：北京化工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R450;O636.12

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本文編號：2082820