發(fā)布時(shí)間：2018-06-23 13:08

  本文選題：全基因組外顯子測序 + DDI2��； 參考：《西北大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：近年來,隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展以及生活習(xí)慣的改變,散發(fā)性結(jié)直腸癌(sporadic colorectal cancer,sCRC)的發(fā)病和死亡人數(shù)也在不斷上升,目前已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的一類惡性腫瘤。根據(jù)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)KRAS、P16和TP53等基因發(fā)生改變與結(jié)直腸癌的發(fā)生息息相關(guān),但仍有30%的結(jié)直腸癌不是由此機(jī)制導(dǎo)致的,因此,探索部分腫瘤中新的發(fā)生機(jī)制及結(jié)直腸癌候選基因有重要意義。全基因組外顯子測序是一種具有高靈敏性的基因組分析方法,它只需要通過對(duì)基因組中1%的序列測序就可以發(fā)現(xiàn)大量的疾病相關(guān)變異。因此,本課題通過全基因組外顯子測序篩選出散發(fā)性結(jié)直腸癌的可能的候選基因DDI2(DNA-damage inducible 1 homolog 2),并選擇LoVo細(xì)胞進(jìn)行體外基因過表達(dá)功能實(shí)驗(yàn),為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。方法首先利用全基因組外顯子測序技術(shù)篩選出三例sCRC癌組織樣本中特異的功能缺失(Loss of Function,LoF)突變基因,結(jié)合相關(guān)生物信息分析方法確定散發(fā)性結(jié)直腸癌候選基因DDI2。之后,根據(jù)前期研究結(jié)果,選擇該基因表達(dá)水平最低的結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo,分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pIRES2-EGFP,質(zhì)粒 pIRES2-DDI2,質(zhì)粒 pIRES2-DDI2 mutant 后,進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察DDI2過表達(dá)對(duì)CRC細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。結(jié)果1)通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DDI2野生組與轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)載體的對(duì)照組相比,結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的遷移能力、侵襲能力、增殖能力均有一定的減弱,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況,DDI2野生組與對(duì)照組相比,結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞的凋亡比率有顯著性差異,這說明DDI2對(duì)于LoVo細(xì)胞增殖能力的影響可能并不是通過細(xì)胞凋亡引起的。3)通過CCK-8檢測5-FU在不同濃度時(shí)的細(xì)胞活性情況,發(fā)現(xiàn)DDI2野生組的細(xì)胞存活率低于對(duì)照組,且在5-FU不同濃度時(shí)均有明顯差異(P0.05),此結(jié)果也表明,DDI2過表達(dá)之后會(huì)降低LoVo細(xì)胞的存活率,降低其對(duì)5-FU的耐藥性。結(jié)論DDI2過表達(dá)可以降低LoVo細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力,降低LoVo細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥性,這也說明DDI2可能參與到sCRC發(fā)病的分子機(jī)制中。
[Abstract]:In recent years, with the rapid development of economy and the change of living habits in China, the incidence and death of sporadic colorectal cancer (sporadic colorectal cancer has been increasing, and it has become a kind of malignant tumor that seriously endangers human health. According to domestic and foreign studies, the changes of KRASP P16 and TP53 genes are closely related to the occurrence of colorectal cancer, but 30% of colorectal cancer is not caused by this mechanism. It is important to explore new mechanisms and candidate genes for colorectal cancer in some tumors. Genome-wide exon sequencing is a highly sensitive method for genome analysis. It can detect a large number of disease-related mutations only by sequencing 1% of the genome. Therefore, the possible candidate gene DDI2 (DNA-damage inducible 1 homolog 2) for sporadic colorectal cancer was screened by genomic exon sequencing in this study. Methods at first, three samples of sCRC cancer tissues were screened by using the whole genome exon sequencing technique to identify the loss of function LoF mutant gene, and the candidate gene DDI2 was identified by the method of bioinformatics analysis. Then, according to the results of previous studies, we selected LoVocells with the lowest expression level of the gene and transfected pIRES2-EGFP, pIRES2-DDI2 and pIRES2-DDI2 mutant, respectively. The effect of DDI2 overexpression on the biological characteristics of CRC cells was observed in vitro. Results 1) the migration ability and invasion ability of colon cancer cell line LoVo were observed by scratch test and Transwell invasion assay. The clone formation assay showed that compared with the control group transfected with the corresponding vector, the migration and invasion ability of colon cancer cell line LoVo were observed in DDI2 wild group. Compared with the control group, there was no significant difference in apoptosis ratio between the two groups. The results showed that the effect of DDI2 on the proliferation of LoVo cells may not be caused by apoptosis. The cell viability of DDI2 wild group was lower than that of control group, and the activity of 5-FU at different concentrations was detected by CCK-8. There were significant differences at different concentrations of 5-FU (P0.05). The results also showed that the overexpression of DDI2 decreased the survival rate of LoVo cells and its resistance to 5-FU. Conclusion the overexpression of DDI2 can reduce the proliferation, migration and invasion of LoVo cells and reduce the resistance of LoVo cells to 5-FU, which suggests that DDI2 may be involved in the molecular mechanism of sCRC.
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2057213