發(fā)布時(shí)間：2018-06-23 11:06

  本文選題：RNA沉默 + 灰飛虱　； 參考：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：水稻是我國乃至全世界重要的糧食作物之一�；绎w虱屬于同翅目飛虱科,是刺吸式口器昆蟲,除直接吸食水稻韌皮部汁液危害水稻外,還能以持久性增殖的方式傳播水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)和水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV),對水稻的生長和發(fā)育極具破壞性,給水稻生產(chǎn)造成重大損失。目前利用RNAi技術(shù)防控植物病毒多采用單一的策略,傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法對環(huán)境污染嚴(yán)重。因此切斷病毒的介體傳播,尋找高效的抗病毒新策略勢在必行。本研究以灰飛虱和水稻條紋病毒為研究材料,利用RNA沉默技術(shù)對可能參與介體傳毒相關(guān)蛋白基因進(jìn)行功能驗(yàn)證;通過干擾介體傳毒相關(guān)蛋白基因和病毒基因的表達(dá),顯著降低了昆蟲體內(nèi)和水稻中病毒的含量;培育獲得具有較高抗性水平的轉(zhuǎn)基因水稻新材料。在此基礎(chǔ)上,研究不同的RNA干擾策略對病毒的防控效果,探尋高效的抗病毒策略。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下:(1)介體傳毒相關(guān)蛋白基因的克隆及功能驗(yàn)證提取灰飛虱總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,用相應(yīng)的引物PCR擴(kuò)增,膠回收后與克隆載體連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,PCR檢測為陽性菌落送于測序。序列分析顯示,GAPDH3全長999bp,編碼332個(gè)氨基酸(GenBank登錄號(hào)為KT724283.1);RACK全長948bp,編碼315個(gè)氨基酸(GenBank登錄號(hào)為KT724285.1)。用體外反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成這2個(gè)基因的dsRNA,參入人工飼料中(終濃度500ng/μL),飼喂2齡帶RSV灰飛虱若蟲。qRT-PCR結(jié)果顯示,dsRNA顯著降低了這2個(gè)基因在灰飛虱中的表達(dá)水平,干擾效果從第1d持續(xù)到第8d;并且能顯著降低灰飛虱中病毒的含量。以上結(jié)果表明,GAPDH3和RACK基因在灰飛虱傳播RSV病毒中起到了至關(guān)重要的作用。(2)原核表達(dá)介體傳毒相關(guān)蛋白基因及病毒基因的dsRNA防控病毒研究構(gòu)建了GAPDH3、RACK及RSV SP基因的單發(fā)夾和嵌合基因雙發(fā)夾的原核表達(dá)載體,導(dǎo)入大腸桿菌M-JM109LacY菌株中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)dsRNA;提取表達(dá)的dsRNA,參入人工飼料中(終濃度500ng/μL),飼喂2齡帶RSV灰飛虱若蟲。qRT-PCR結(jié)果表明,各原核表達(dá)的dsRNA均能顯著降低相應(yīng)基因的表達(dá)水平,干擾效果從第1d持續(xù)到第8d;并且能顯著降低灰飛虱中病毒的含量;共沉默介體傳毒相關(guān)蛋白基因和RSV SP基因誘導(dǎo)表達(dá)的dsRNA干擾效果優(yōu)于只沉默介體傳毒相關(guān)蛋白基因或RSV SP基因誘導(dǎo)表達(dá)的dsRNA。在此基礎(chǔ)上,將誘導(dǎo)表達(dá)的共沉默介體傳毒相關(guān)蛋白基因和RSV SP基因的dsRNA溶于TE中(終濃度500ng/μL),噴施于野生型水稻上,接種2齡帶RSV灰飛虱若蟲,分別于6d和8d移出灰飛虱若蟲。qRT-PCR結(jié)果表明,各dsRNA均能降低水稻中病毒的含量。(3)轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)介體傳毒相關(guān)蛋白基因及病毒基因的dsRNA抗病毒研究構(gòu)建了GAPDH3、RACK基因和RSV SP基因的嵌合雙發(fā)夾植物表達(dá)載體,凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105,轉(zhuǎn)化水稻品種臨稻10,獲得了含各載體的轉(zhuǎn)基因水稻植株。轉(zhuǎn)基因植株Southern blot分析結(jié)果表明,各外源基因以不同的拷貝數(shù)整合到水稻基因組中;Northern blot分析結(jié)果表明,外源基因在植株體內(nèi)可正常轉(zhuǎn)錄為mRNA,隨后mRNA可剪切為siRNA。待T1代轉(zhuǎn)基因水稻幼苗5葉期時(shí),以野生型臨稻10作為對照,接種2齡帶RSV灰飛虱若蟲,3d后移出灰飛虱若蟲。3周后調(diào)查結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因植株SP+GAPDH3對RSV的抗病率為33.33%,轉(zhuǎn)基因植株SP+RACK對RSV的抗病率為50%。已有研究顯示,轉(zhuǎn)基因植株RSV SP對RSV的抗病率為29.41%。表明共沉默介體傳毒相關(guān)蛋白基因及病毒基因的轉(zhuǎn)基因水稻比只沉默病毒基因的轉(zhuǎn)基因水稻具有更高的對RSV的抗病性。
[Abstract]:Rice stripe virus ( RSV ) and rice black - dwarf virus ( RBS ) were amplified by using RNA silencing technique . The results and conclusions were as follows : ( 1 ) The RNA silencing technique was used to study the effect of rice stripe virus ( RSV ) and rice black stripe dwarf virus ( KT724285.1 ) . ( 3 ) The results showed that the dsRNA could reduce the virus content in rice . The results showed that all the dsRNA could reduce the virus content in rice .
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S435.11

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2056913