本文選題：DNA + siRNA��； 參考：《華東師范大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：基因和蛋白質(zhì)治療是一種新興的疾病治療手段,它相比于傳統(tǒng)的治療方法,具有靶向性強(qiáng),副作用小,治療效果明顯等優(yōu)勢,因此成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。基因和蛋白質(zhì)自身很難進(jìn)入細(xì)胞,在實際應(yīng)用過程中需要載體來遞送。陽離子高分子是當(dāng)前研究最多的一類基因和蛋白質(zhì)載體。然而,這些高分子載體普遍存在轉(zhuǎn)染效率不高,毒副作用大等問題,因而需要對其進(jìn)行各種功能化修飾來改善這些載體的性能。常用的高分子載體改性方法包括脂肪鏈修飾,糖基化修飾.,氨基酸修飾,小肽和蛋白質(zhì)修飾,納米材料修飾等。但這些修飾方法無法從根本上解決陽離子高分子轉(zhuǎn)染過程中帶來的細(xì)胞毒性等問題。因此,開發(fā)高效、低毒的基因和蛋白質(zhì)載體一直是該研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。氟化修飾是一種改善陽離子高分子基因轉(zhuǎn)染效率的新策略。這種方法修飾的高分子材料可以在極低的氮磷比條件下實現(xiàn)高效基因轉(zhuǎn)染,低氮磷比也會降低復(fù)合物表面的電荷密度,從而緩解陽離子高分子對細(xì)胞的毒副作用。但是,氟化修飾的高分子材料要獲得高轉(zhuǎn)染效率往往需要在高分子表面接枝高比例的含氟脂肪鏈,這樣會帶來一系列的問題。比如,高表面接枝率會造成高分子表面產(chǎn)生嚴(yán)重的空間位阻,影響高分子材料與核酸分子結(jié)合,也限制了在高分子材料上進(jìn)行其它的功能化修飾；另外,接枝大量的含氟脂肪鏈也可能會產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。本論文針對這些問題,擬采用在高分子表面修飾含雙氟鏈的化合物來使得高分子可以在低接枝率條件下實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率。即在不同的高分子材料表面修飾2-氯-4,6-雙[3-(全氟己基)丙氧基]-1,3,5-三嗪(CBT),探索其作為DNA, siRNA和蛋白質(zhì)載體的可行性。論文的主要研究結(jié)果介紹如下：在不同代數(shù)(Generation, G)的聚酰胺-胺樹形高分子(PAMAM)和分子量為1800 Da的支化聚乙烯亞胺(bPEI1.8K)上修飾不同比例的CBT分子,并通過茚三酮和氟元素分析等方法表征這些材料表面CBT的平均接枝數(shù)量。所得材料分別定義為GI-CBT1.9, G2-CBT1.5,G5-CBTi.3和bPEI1.8K-CBTi.3 (CBT后的數(shù)字下標(biāo)為CBT的平均接枝數(shù))。研究結(jié)果表明所有CBT修飾的高分子材料均可以緊密結(jié)合DNA。僅僅修飾1-2條CBT后,所有的高分子材料轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白和熒光素酶的效率均大幅提高。其中,GI-CBT1.9的轉(zhuǎn)染效率提高最為顯著,在HEK293細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到了70%以上,與商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000近乎相當(dāng),顯著優(yōu)于SuperFect和PolyFect。這些CBT修飾的高分子材料除了高轉(zhuǎn)染效率外,在轉(zhuǎn)染條件下幾乎未對細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。除了具有較高的DNA轉(zhuǎn)染能力,CBT修飾的高分子材料還能夠有效遞送siRNA。比如,G1-CBT1.9, G2-CBT1.5, G5-CBT1.3和bPEI1.8K-CBTi.3在穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的HeLa和MDA-MB-231細(xì)胞中均能有效干擾熒光素酶基因的表達(dá)水平,而且在RNA干擾過程中未檢測到脫靶現(xiàn)象。其中,GI-CBT1.9的RNA干擾效率與Lipofectamine 2000相當(dāng),而且基因沉默過程中細(xì)胞毒性更低。GI-CBT1.9不僅在體外具有較高的RNA干擾水平,在小鼠體內(nèi)也展示了一定的基因沉默能力,顯著優(yōu)于未進(jìn)行CBT修飾的G1樹形高分子材料。這一結(jié)果表明GI-CBT1.9具有作為潛在的基因治療載體的可能。雖然氟化修飾的高分子材料作為DNA和siRNA的遞送載體已有相關(guān)報道,但是其作為蛋白質(zhì)載體的可行性還未進(jìn)行探索。研究結(jié)果表明GI-CBT1.9, G2-CBT1.5和bPEI1.8K-CBTi.3均可將修飾綠色熒光素的牛血清蛋白(BSA-FITC)遞送進(jìn)HeLa細(xì)胞。三種載體中,GI-CBT1.9對BSA-FITC遞送效率最高,這與前面DNA和siRNA的轉(zhuǎn)染結(jié)果一致,表明GI-CBT1.9遞送這幾種生物分子采用了類似的機(jī)理。除了BSA-FITC之外,GI-CBT1.9還可以將β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,β-Gal)遞送進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。綜上所述,本論文提供了一種新的氟化修飾方法用于改善陽離子高分子對基因和蛋白質(zhì)的遞送性能。相對于傳統(tǒng)的含氟脂肪鏈修飾,雙氟鏈修飾法可以在極低的氟鏈接枝率(1-2條CBT分子)條件下實現(xiàn)高效、低毒的基因和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染。這種方法簡單易行,具有較高的商業(yè)化應(yīng)用前景。該研究進(jìn)一步完善了氟化修飾高分子的基因遞送系統(tǒng),并且拓展了氟化高分子在蛋白質(zhì)遞送中的應(yīng)用。
[Abstract]:Gene and protein therapy is an emerging disease treatment method , which has the advantages of strong targeting property , small side effect and obvious therapeutic effect compared with traditional treatment method .
The results showed that the transfection efficiency of GI - CBT1 . 9 , G2 - CBT1.5 , G5 - CBT1.3 and bPEI1.8K - CBTi . 3 were significantly better than that of SuperFect and PolyFect . The results showed that the transfection efficiency of GI - CBT1.9 , G2 - CBT1.5 , G5 - CBT1.3 and bPEI2.8K - CBT.3 were significantly better than those of SuperFect and PolyFect .
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q789

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本文編號：2054837