本文選題：間充質基質細胞 + 胞外囊泡　； 參考：《中國人民解放軍醫(yī)學院》2016年博士論文

【摘要】：研究背景目前,異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)是某些惡性血液病的唯一治愈方法。急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD)是allo-HSCT后受者死亡的主要原因。迄今為止尚無最佳aGVHD預防方法,亟需開發(fā)更有效的預防方案。間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)因其獨特的免疫調節(jié)及組織修復能力,成為allo-HSCT過程中細胞療法的理想“候選者”。大量臨床試驗提示過繼性輸注MSCs能夠預防allo-HSCT后致死性aGVHD的發(fā)生,并且能夠促進造血重建。然而,MSCs的多向分化能力及其體內長期生存活性對受者遠期影響不明,出于安全性考慮限制了MSCs的廣泛應用。近年來研究提示胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)介導的旁分泌機制在MSCs為基礎的治療中發(fā)揮關鍵作用,并且越來越多的臨床前及臨床試驗提示在組織修復及免疫調節(jié)領域,MSCs來源的外泌體及微泡有望替代MSCs發(fā)揮作用。研究目的本研究擬探討人臍帶間充質干細胞來源胞外囊泡(EVs released from human umbilical cord derived MSCs,hUC-MSC-EVs)在allo-HSCT中是否可以預防aGVHD和促進造血重建及可能的機制。研究方法及結果①Allo-HSCT小鼠模型的建立。BALB/c小鼠7.5Gy X射線全身照射后4-6小時內輸注C57BL/6小鼠6×106骨髓細胞及3×106脾細胞。移植后21天左右受鼠出現(xiàn)明顯的體重下降、活動度減少、弓背、豎毛、皮膚裸露等aGVHD臨床表現(xiàn)。相應地,移植后1個月aGVHD靶器官：皮膚、肝臟、腸道出現(xiàn)典型的組織形態(tài)學改變。移植后約兩個月,受鼠全部死于嚴重的aGVHD。② hUC-MSC-EVs的分離及鑒定。hUC-MSCs在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后收集細胞培養(yǎng)上清,2000g離心30分鐘以去除細胞及碎片。上清給予兩次100000g,2小時,4℃超速離心。PBS重懸最終EVs沉淀。BCA法測定hUC-MSC-EVs蛋白濃度。透射電子顯微鏡觀察hUC-MSC-EVs是一群直徑介于30到100納米大小的異質性球狀體。③探究hUC-MSC-EVs對allo-HSCT小鼠aGVHD的預防作用。allo-HSCT第0天、第7天分別輸注200μg hUC-MSC-EVsohUC-MSC-EVs輸注組受鼠aGVHD臨床表現(xiàn)減輕,靶器官組織形態(tài)學改變減輕,死亡率降低。淋巴細胞亞群檢測提示hUC-MSC-EVs輸注組受鼠CD3+CD8+T細胞比例及絕對值明顯降低,但CD3+CD4+/CD3+CD8+T細胞比例升高。此外,hUC-MSC-EVs輸注組受鼠促炎細胞因子：IL-2、TNF-α及IFN-y水平降低,抗炎細胞因子：IL-10水平增高。與此一致,體外實驗提示hUC-MSC-EVs處理組絲裂原誘導的小鼠淋巴細胞增殖受抑,且細胞因子變化模式與體內實驗相似。④探究hUC-MSC-EVs對allo-HSCT后小鼠造血重建的影響。allo-HSCT第0天輸注200μg hUC-MSC-EVs。hUC-MSC-EVs輸注組小鼠外周血象恢復時間縮短。體外實驗發(fā)現(xiàn)hUC-MSC-EVs處理組小鼠骨髓細胞各系集落形成率增加。研究結論①成功建立了allo-HSCT小鼠模型;②差異離心法是獲取hUC-MSC-EVs的有效方法;③ hUC-MSC-EVs通過調節(jié)免疫反應預防allo-HSCT后aGVHD的發(fā)生;④ hUC-MSC-EVs促進allo-HSCT后造血重建。
[Abstract]:Background, allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) is the only cure for some malignant hematopathy. Acute graft-versus-host disease (acute graft-versus-host disease, aGVHD) is the main cause of death after allo-HSCT. So far, there is no best aGVHD preconditioning. Mesenchymal stem cells (MSCs) is an ideal candidate for cell therapy in allo-HSCT process because of its unique immunomodulatory and tissue repair ability. A large number of clinical trials suggest that adoptive infusion of MSCs can prevent the occurrence of fatal aGVHD in allo-HSCT after allo-HSCT. However, the multiple differentiation ability of MSCs and the long-term survival activity of the body and the long-term survival activity of the body are unknown, and the wide application of MSCs is limited out of safety considerations. In recent years, research suggests that the parapet mechanism mediated by extracellular vesicles (EVs) plays a key role in MSCs based treatment. Use, and more and more preclinical and clinical trials are suggested in the field of tissue repair and immunomodulation. The exocrine and microbubbles of MSCs sources are expected to replace MSCs. The purpose of this study is to explore the origin of extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells (EVs released from human umbilical cord derived MSCs, hUC-MSC-EVs) in allo Whether or not -HSCT can prevent aGVHD and promote hematopoiesis and possible mechanism. Research methods and results (1) the establishment of Allo-HSCT mice model of.BALB/c mice after 7.5Gy X ray whole body irradiation of C57BL/6 mice within 4-6 hours of infusion of 6 x 106 bone marrow cells and 3 x 106 spleen cells. After 21 days of transplantation, the mice were exposed to significant weight loss and activity degree. AGVHD clinical manifestations, such as reduction, arbor, erect hair, skin exposure, etc. correspondingly, 1 months after transplantation, aGVHD target organs: skin, liver, and intestines have typical histomorphological changes. About two months after transplantation, all rats died of severe aGVHD. (2) hUC-MSC-EVs separation and identification, and.HUC-MSCs was collected in serum-free medium after 48 hours of culture. Cell culture supernatant, 2000g centrifugation for 30 minutes to remove cells and debris. The supernatant was given two times 100000g, 2 hours, 4 C overspeed centrifugation.PBS suspension final EVs precipitation.BCA method for the determination of hUC-MSC-EVs protein concentration. The transmission electron microscope observation hUC-MSC-EVs is a group of heterogeneous spheroids with a diameter of 30 to 100 nanometers. (3) explore hUC-MSC-EVs pairs The preventive effect of aGVHD in allo-HSCT mice was.Allo-HSCT for zeroth days, and on the seventh day, the clinical manifestations of aGVHD in the 200 mu g hUC-MSC-EVsohUC-MSC-EVs infusion group were relieved, the morphological changes of the target organs were reduced and the mortality was reduced. The lymphocyte subgroup detection suggested that the proportion and absolute value of CD3+CD8+T cells in the hUC-MSC-EVs infusion group decreased significantly. The proportion of CD3+CD4+/CD3+CD8+T cells increased. In addition, the level of IL-2, TNF- alpha and IFN-y decreased in the hUC-MSC-EVs infusion group, and the level of anti-inflammatory cytokines: IL-10 increased. In vitro experiments, it was suggested that the proliferation of lymphatic cell proliferation induced by mitogen in hUC-MSC-EVs treated mice was inhibited, and the pattern of cytokines changes in the body and the body were in the body. The effect of hUC-MSC-EVs on the hematopoietic reconstitution of mice after allo-HSCT was studied. The recovery time of peripheral hemogram of mice in the zeroth day infusion group of 200 mu g hUC-MSC-EVs.hUC-MSC-EVs infusion group was shortened. The colony formation rate of each mouse bone marrow cell in the hUC-MSC-EVs treatment group was added in vitro. The conclusion was that (1) a successful establishment of allo-HSCT was established. The mouse model; differential centrifugation method is a effective method to obtain the hUC-MSC-EVs; the hUC-MSC-EVs aGVHD by regulating the immune response after allo-HSCT and hUC-MSC-EVs promote prevention; reconstruction after hematopoietic allo-HSCT.
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R457.7

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本文編號：2047774