本文選題：豬流行性腹瀉病毒 + S基因　； 參考：《安徽農業(yè)大學》2016年碩士論文

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種高度接觸性腸道傳染病。該病在1971年首次報道于英國,1976年我國也證實了本病。目前,PED已經成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)最為嚴重的病毒性傳染病之一,給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經濟損失。近幾年,我國PED的發(fā)病率、死亡率均呈上升趨勢,尤其是自2010年10月以來,PED在我國的流行廣泛并呈現新的特點。感染PEDV后,哺乳仔豬死亡率達80%-100%,而繁殖母豬和公豬則很少表現出臨床癥狀。病毒的變異可能是引起PED大規(guī)模爆發(fā)的原因,這給本病的防治帶來了新的挑戰(zhàn)。因此對于PEDV基因遺傳進化的分析以及建立一種快速、可靠的PEDV抗體檢測方法,進行PED流行病學的監(jiān)測以及豬群免疫過PED疫苗后抗體水平的檢測,對于本病的預防具有重要意義。本研究內容包括以下部分:1:安徽地區(qū)PEDV S基因遺傳進化分析為分析2014-2015年安徽地區(qū)豬流行性病毒(PEDV)的變異情況,本研究設計合成3對特異性引物,對2014-2015年采集自安徽省12個地級市21個不同地區(qū)發(fā)生腹瀉的豬場,經檢測為PEDV陽性的病料,對這21株PEDV毒株的S基因全基因序列測序,并對其進行遺傳進化分析。結果表明,21株PEDV安徽地區(qū)毒株除AHBB-1外,20株PEDV安徽地區(qū)毒株S基因全長均為4161bp。21株PEDV S基因核苷酸和氨基酸的同源性分別為96.3%-99.9%和96.0%-99.8%;與經典CV777株核苷酸和氨基酸同源性分別為93.7%-95.9%和92.6%-96.8%。21株安徽毒株除AHBB-1株外,其他20株S基因均存在相同的插入和缺失,這些位點核苷酸的插入和缺失導致了其編碼的氨基酸相應改變。S基因系統進化樹分析結果表明,21株安徽毒株除AHBB-1外20株處于同一分支,且與2011-2012年的6株中國其它地區(qū)毒株、2014年的2株中國其他地區(qū)毒株、2005-2009年3株韓國毒株親緣關系均較密切,而與歐洲株(CV777、Brl)、中國現用疫苗株(CV777-vaccine)及中國早期分離株CH/S親緣關系均較遠。S蛋白抗原位點分析表明,安徽分離株與現用疫苗株(CV777-vaccine)相比,流行毒株S蛋白的主要抗原位點及COE區(qū)域均發(fā)生了變異。2.間接ELISA檢測方法的建立利用生物學軟件分析PEDV S蛋白抗原位點,選擇編碼親水性較強、抗原指數較高且表面可及性好的區(qū)域,針對這個區(qū)域設計一對特異性引物,以PEDV基因組反轉錄后c DNA為模板進行擴增,擴增產物回收、純化后克隆至原核表達載體p ET-32a(+)中,構建原核表達重組載體p ET-32a-S,經重組質粒轉化至表達菌BL21中進行誘導表達,以SDS-PAGE蛋白電泳鑒定是否表達及表達形式;以Western-blot鑒定重組蛋白的免疫活性。摸索重組S蛋白的最佳表達條件,對重組蛋白S進行純化,用純化后的S蛋白作為包被物,建立PEDV抗體間接ELISA檢測方法,并與進口商品化PEDV抗體試劑盒和Western-blot金標準進行對比試驗,比較二者的符合率、敏感性和特異性。結果表明:本研究成功擴增出所需S基因片段并構建重組載體p ET-32a-S,誘導表達出重組S蛋白,經Western-blot分析驗證具有良好的反應原性。通過對建立間接ELISA檢測方法的優(yōu)化,最終確定反應的最佳蛋白包被濃度為8mg/L,封閉液為2%BSA,一抗的最佳稀釋度為1:40,最佳作用時間為30min,羊抗豬Ig G-HRP最佳稀釋度1:1500稀釋,最佳作用時間為45min,顯色時間為10min。重復試驗表明組內及組間變異系數均小于10%,重復性較好。與進口商品化PEDV抗體檢測試劑盒相比符合率、敏感性和特異性為86.67%、89.83%、82.62%;與western-blot檢測結果相比,符合率、敏感性和特異性88.89%、90.20%、83.33%。結果表明:以表達的重組S蛋白為包被抗原建立的間接ELISA檢測方法特異性高、變異性小、符合率高。可用于生產中PEDV抗體水平的檢測。
[Abstract]:In recent years , the genetic evolution of PEDV S gene in Anhui region has become one of the most serious infectious diseases in China . The recombinant plasmid pET - 32a - S was cloned into prokaryotic expression vector pET - 32a ( + ) by Western - blot . and can be used for detecting the level of PEDV antibody in production .
【學位授予單位】：安徽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 曹貝貝;韓麗;于朋飛;蘭培英;程慧芳;宋月;胡慧;;豬流行性腹瀉病毒SYBR Green Ⅰ熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J];中國預防獸醫(yī)學報;2015年06期

2 姜艷平;姜新鵬;孫劉妹;趙廣宇;崔文;唐麗杰;喬薪瑗;李一經;;豬流行性腹瀉病毒重組N蛋白間接ELISA檢測方法的建立[J];中國預防獸醫(yī)學報;2015年02期

3 余海波;;豬流行性腹瀉的診斷方法與防控措施[J];中國畜牧業(yè);2015年03期

4 李一經;劉博;姜艷平;崔文;唐麗杰;喬薪瑗;劉敏;;雙抗體夾心ELISA檢測排泄物PEDV[J];東北農業(yè)大學學報;2015年02期

5 徐宏軍;楊鵬程;任麗;胡來根;何孔旺;劉文倩;代洪波;;豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗的制備及攻毒保護研究[J];動物醫(yī)學進展;2015年01期

6 時曉麗;談晨;趙攀登;白娟;李玉峰;姜平;;豬流行性腹瀉病毒抗原捕獲ELISA抗體檢測方法的建立與應用[J];中國獸醫(yī)科學;2014年12期

7 雷利;彭姣;祁振強;秦智峰;盧超;;豬流行性腹瀉病毒雙抗夾心ELISA的建立[J];中國動物檢疫;2014年12期

8 王隆柏;林裕勝;車勇良;吳學敏;陳如敬;邵良平;周倫江;;豬流行性腹瀉病毒S、N和ORF3基因的遺傳變異分析[J];畜牧獸醫(yī)學報;2014年11期

9 丁振江;庫旭鋼;閆貴偉;陳淑華;何啟蓋;;豬流行性腹瀉IgA抗體間接ELISA檢測方法的建立[J];畜牧與獸醫(yī);2014年11期

10 陳靜;王曉夢;楊盼盼;雷喜梅;劉金玲;李曉靜;趙軍;王川慶;;基于PEDV中國變異株S蛋白間接ELISA抗體檢測方法的建立與應用[J];中國獸醫(yī)學報;2014年10期

，

本文編號：1968000