本文選題：MCR基因 + 基因敲降��； 參考：《畜牧獸醫(yī)學報》2017年03期

【摘要】：旨在研究黑素皮質(zhì)激素4受體基因(Melanocortin-4receptor,MC4R)沉默對牛成纖維細胞內(nèi)能量與脂肪代謝相關通路上基因表達的影響,進一步揭示MC4R基因與肉牛胴體品質(zhì)以及能量平衡與脂肪代謝之間的關系。本試驗使用MC4R被敲降的牛成纖維細胞系,借助深度測序技術尋找試驗組(MC4R敲降)和陰性對照組(MC4R未敲降)中表達量差異顯著的基因。利用GO注釋聚類分析和KEGG通路富集分析對涉及能量代謝、脂肪運輸及相關調(diào)控通路的差異基因進行了深入的富集分析。隨機選取差異表達基因中的10個基因,利用實時定量PCR對深度測序結果進行驗證。此外,本研究借助牛SNP芯片對上述目標基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進行了檢測,并對136頭西門塔爾牛進行了基于目標基因各SNP的基因型檢測�；诟鱏NP的分型數(shù)據(jù),本研究進一步利用PLINK軟件對SNP與牛各胴體性狀的關聯(lián)性進行分析。通過深度測序,在兩組陽性MC4R被敲降的牛成纖維細胞系中共發(fā)現(xiàn)7 799個差異表達基因,其中上調(diào)基因1 703個,下調(diào)基因6 096個。顯著性GO分類在兩組不同干擾水平處理組間共選出與能量代謝調(diào)節(jié)、脂肪運輸過程相關的差異表達基因265個,功能聚類分析進一步篩選出與能量代謝相關的基因29個。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),與能量代謝、脂肪運輸?shù)冗^程相關的265個差異表達基因共涉及到40個不同的通路,其中與MC4R基因及能量代謝調(diào)控有密切關聯(lián)的Leptin、AGRP、NPY和POMC等基因同屬于脂聯(lián)素信號通路。MC4R敲降引起該通路上22個基因的表達發(fā)生顯著變化。實時定量PCR結果表明,所選擇的10個基因(表達量上調(diào)基因:CFB、RSAD2、IFIT3、CHI3L1和BOLA-N;表達量下調(diào)基因:UPK1B、IER2、LASS3、TGFβ3和AXUD1)的mRNA表達水平與測序結果無顯著差異,從而證實了深度測序數(shù)據(jù)的準確性和可重復性。此外,借助50K密度的牛SNP芯片,本研究共發(fā)現(xiàn)了16個SNPs位點,共涉及11個目標基因。SNPs與牛各胴體性狀的關聯(lián)分析結果表明,10號染色體上的TGFβ3對西門塔爾牛眼肌面積、胴體重、腰部肉厚、大腿肉厚和外脊重有顯著影響(P0.05),對眼肉重、里脊重有極顯著影響(P0.01);同樣位于10號染色體的RHOJ基因?qū)ξ鏖T塔爾牛眼肌面積也有顯著影響(P0.05)。19號染色體上的KRT17基因和7號染色體上VCAN基因均顯著影響西門塔爾牛肉剪切力(P0.01,P0.05)。1號染色體的MASP1基因?qū)θ馍酗@著影響(P0.05)。結果顯示,MC4R基因沉默顯著影響牛成纖維細胞內(nèi)參與能量代謝、脂肪代謝和能量穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)控過程相關基因的表達,進一步證實了MC4R基因能調(diào)控肉牛能量平衡和脂肪代謝以及影響肉牛胴體品質(zhì)。
[Abstract]:To study the effect of melanocortin-4 receptor MC4R silencing on gene expression in the pathway related to energy and fat metabolism in bovine fibroblasts. The relationship between MC4R gene and carcass quality, energy balance and fat metabolism in beef cattle was further revealed. In this experiment, the bovine fibroblast cell line with MC4R knockdown was used to find the genes with significant difference in the expression of MC4R knockdown between the test group and the negative control group by deep sequencing technique. Go annotation cluster analysis and KEGG pathway enrichment analysis were used to analyze the differential genes involved in energy metabolism, fat transport and related regulatory pathways. Ten genes of differentially expressed genes were randomly selected and the results of deep sequencing were verified by real-time quantitative PCR. In addition, single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the target genes were detected by bovine SNP microarray, and genotypes based on SNP of the target genes were detected in 136 Simmental cattle. Based on the classification data of SNP, the relationship between SNP and carcass traits in cattle was further analyzed by PLINK software. By deep sequencing, a total of 7 799 differentially expressed genes were found in two groups of bovine fibroblast cell lines with positive MC4R knockdown, including 1 703 up-regulated genes and 6 096 down-regulated genes. Significant go classification selected 265 differentially expressed genes related to the regulation of energy metabolism and fat transport between the two groups at different interference levels. Functional cluster analysis further screened 29 genes related to energy metabolism. KEGG pathway enrichment analysis showed that 265 differentially expressed genes related to energy metabolism and fat transport were involved in 40 different pathways. The expression of 22 genes in the MC4R gene and the regulation of energy metabolism, which is closely related to the MC4R gene and the regulation of energy metabolism, belongs to the adiponectin signaling pathway. MC4R knockdown causes a significant change in the expression of 22 genes in this pathway. The results of real-time quantitative PCR showed that there was no significant difference between the mRNA expression levels of the 10 genes (up-regulation gene RSAD2IFIT3, CHI3L1 and BOLA-Nand down-regulated gene UPK1BER2LASS3TGF- 尾 3 and AXUD1), which confirmed the accuracy and repeatability of the deep sequencing data. In addition, with the help of 50K density bovine SNP chip, a total of 16 SNPs loci were found in this study, involving 11 target genes SNPs and carcass traits. The results showed that TGF 尾 3 on chromosome 10 had eye muscle area and carcass weight in Simmental cattle. The thickness of waist, thighs and outer ridges had a significant effect on the weight of eye meat. The KRT17 gene on chromosome 19 and the VCAN gene on chromosome 7 have a significant effect on the eye muscle area of Simmental cattle, and the RHOJ gene also located on chromosome 10 has a significant effect on the area of eye muscle of Simmental cattle. Both the KRT17 gene on chromosome 19 and the VCAN gene on chromosome 7 have significant effects on the beef of Simmental cattle. The MASP1 gene of chromosome 1 has a significant effect on meat color. The results showed that MC4R gene silencing significantly affected the expression of genes involved in energy metabolism, fat metabolism and energy homeostasis regulation in bovine fibroblasts. It was further confirmed that MC4R gene could regulate energy balance, fat metabolism and carcass quality of beef cattle.
【作者單位】： 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所;洛陽師范學院生命科學學院;
【基金】：轉基因生物新品種培育重大專項(2013ZX08007-2;2014ZX08007-2) 中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS03)
【分類號】：S823

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