本文選題：玉米赤霉烯酮 + 密碼子優(yōu)化��； 參考：《湖北大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的一種非固醇類雌激素真菌毒素,最初由Stob等從發(fā)霉玉米中分離得到。ZEN在世界各地的谷物及其副產(chǎn)品中污染廣泛,在玉米、大麥、小麥等谷物及其副產(chǎn)品中經(jīng)常能檢測(cè)到ZEN。ZEN通過污染的谷物農(nóng)副產(chǎn)品及飼料進(jìn)入食物鏈,并在人體與動(dòng)物體內(nèi)累積。進(jìn)入人體與動(dòng)物體內(nèi)的ZEN會(huì)引起雌激素綜合癥狀,導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)雌激素過多,引起不孕不育,并有很強(qiáng)的致癌性和基因毒性。ZEN在谷物飼料中的污染,不僅在全球造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也威脅到人體健康。為了保障食品安全,對(duì)真菌毒素ZEN的脫毒技術(shù)具有重大的意義。傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法并不能有效地去除谷物中的毒素,并會(huì)破壞谷物的營(yíng)養(yǎng)成分,影響食物的口感。酶降解不僅可以高效的將ZEN轉(zhuǎn)化為無毒性產(chǎn)物,安全環(huán)保,而且酶催化反應(yīng)專一性強(qiáng)、降解效率高,不會(huì)破壞谷物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2002年,Takahashi-Ando等從粉紅粘帚霉中克隆得到ZEN降解酶基因zhd101并在大腸桿菌表達(dá)驗(yàn)證,重組酶能有效地酶降解ZEN。但是,目前zhd101表達(dá)得到的酶液降解ZEN的效率都比較低,也還沒有通過基因優(yōu)化、構(gòu)建多拷貝等策略提高zhd101在畢赤酵母中表達(dá)量的報(bào)道。本論文將ZEN降解酶基因zhd101按照畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化,人工合成優(yōu)化后的基因序列zhd。同時(shí),通過生物磚方法體外構(gòu)建了 zhd基因1-4拷貝畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pHBM905BDM-zhd。用Sal分別將1-4拷貝重組質(zhì)粒線性化,電轉(zhuǎn)化畢赤酵母Ppastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞,得到含有zhd基因不同拷貝數(shù)的重組畢赤酵母菌株,將含有1-4拷貝的重組酵母菌株分別命名為X1c、X2c、X3c、X4c。搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)顯示,隨著拷貝數(shù)的增加,ZHD蛋白表達(dá)量逐漸增加,當(dāng)增加到四拷貝時(shí),X4c菌株ZHD的表達(dá)量開始降低了。重組酵母菌株X1c、X2c、X3c、X4c的ZHD蛋白表達(dá)量分別為 0.03 mg/mL、0.062 mg/mL、0.083 mg/mL、0.058 mg/mL。并且首次定義 ZHD 降解ZEN的酶活單位U,純化過后的ZHD蛋白降解ZEN的酶活為42.3 U/mL,比酶活為4976.5 U/mg。X3c菌株搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)3天的上清酶活為22.5 U/mL,15 min能降解6.34 Iμg/mLZEN。而同樣來源G.roseum、與zhd101基因高達(dá)98%的同源性的兩基因ZEN-jjm和zlhy-6在畢赤酵母中表達(dá),發(fā)酵上清降解ZEN的酶活都相對(duì)較低。ZEN-JJM降解1μg/mL ZEN需要長(zhǎng)達(dá)9 h,而ZLHY-6降解1.6μg/mLZEN也需要4 h。將重組酵母菌株X3c在5 L發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵,ZHD降解ZEN的酶活最高達(dá)到150.1 U/mL,是搖瓶發(fā)酵水平的6.7倍。
[Abstract]:ZEN is used to transform ZEN into non - toxic products . ZEN - jjm and zlhy - 6 were digested with ZEN - JJM . The activity of ZEN - jjm and zlhy - 6 in ZEN was 22.5 U / mL and 6.34 I 渭g / mL ZEN .
【學(xué)位授予單位】：湖北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1958953