本文選題：外泌體 + 穩(wěn)定性��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：腫瘤的個體化治療是以患者的藥物基因組學(xué)為基礎(chǔ),制定針對每個患者自身合理的治療方案,以期最大限度的獲得臨床療效并降低毒副作用治療模式。個體化治療的前提條件是要進行腫瘤組織的病理學(xué)基因檢測,但是由于腫瘤早期不易發(fā)現(xiàn)、取材困難以及腫瘤異質(zhì)性等原因,患者的診斷及后續(xù)治療受到了諸多方面的限制。因此,尋找一種簡便易得同時與腫瘤組織基因變化相一致的替代物成為個體化治療的重要任務(wù)。外泌體(exosomes)是一類起源于細胞內(nèi)吞體系統(tǒng)的納米級小囊泡,直徑在30-150nm之間,在電鏡下呈現(xiàn)球形或杯狀的形態(tài),擁有穩(wěn)定的雙層膜結(jié)構(gòu),通過胞吐作用排出細胞外,并隨之進入血流或其他體液系統(tǒng)中。人體內(nèi)幾乎所有細胞都能分泌產(chǎn)生外泌體。外泌體幾乎分布于人體內(nèi)所有的體液系統(tǒng),是細胞間溝通聯(lián)系的橋梁。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤患者體內(nèi)的外泌體數(shù)量遠高于健康人,更為重要的是外泌體內(nèi)含有雙鏈DNA,并且這些DNA所攜帶的基因信息在某種程度上與腫瘤細胞DNA具有一致性。本研究旨在探索結(jié)直腸癌患者血清外泌體中DNA的突變情況與腫瘤組織基因突變之間的相互關(guān)系,進而論證外泌體作為一種新型基因檢測手段指導(dǎo)個體化治療的可行性。外泌體如果想成為基因檢測的理想材料,除了取材方便、含量豐富之外必須具備相當程度的穩(wěn)定性,這是一切后續(xù)工作的前提和基礎(chǔ)。所以在本文第一章中我們著重討論外泌體的穩(wěn)定性。我們將新鮮采集的血清樣本分裝后分別儲存在4°C(24h,72h,168h);室溫(6h,12h,24h,48h);-80°C反復(fù)凍融(1次,3次,5次)的條件下。用新鮮分離的血清作為對照,分別提取上述各個條件下的血清外泌體,同時保留去除外泌體之后的剩余血清。隨后提取外泌體及剩余血清中的蛋白質(zhì)和DNA,通過對外泌體特異性標志物TSG101和CD63蛋白的Western blot驗證和DNA的PCR擴增及Sanger測序等方法分別對外泌體及外泌體DNA的穩(wěn)定性進行了驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),外泌體DNA是血清DNA的主要來源,并且無論外界環(huán)境如何變化,外泌體都能處于一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。這種穩(wěn)定狀態(tài)的持續(xù)時間隨儲存環(huán)境的變化而改變:從4°C儲存的血清中提取得到的外泌體及其DNA最為穩(wěn)定,這種穩(wěn)定性可以持續(xù)至少1周的時間;在室溫下外泌體至少可以穩(wěn)定1天的時間;反復(fù)凍融對外泌體的破壞最為嚴重,凍融3次以后血清中的外泌體及其DNA被大量破壞。但是,即便是在室溫放置48h乃至凍融5次的情況下,外泌體DNA依然能進行PCR擴增并檢測出與新鮮血清外泌體一致的基因突變。以上結(jié)果不僅充分說明了外泌體及外泌體DNA具有極強的穩(wěn)定性,而且提供了這種穩(wěn)定性存在的持續(xù)時間,為外泌體作為一種新型的腫瘤基因檢測手段提供了可靠的保證。為了研究外泌體內(nèi)的基因狀態(tài)是否與腫瘤組織基因檢測的結(jié)果相一致,在本文第二章的實驗中,我們隨機收集了96例經(jīng)病理組織學(xué)基因檢測明確KRAS基因狀態(tài)的結(jié)直腸癌患者的血清,分別進行了血清外泌體和血細胞DNA的提取。隨后選取了與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的6個基因8個基因位點(KRAS G12 G13,KRAS Q61,BRAF V600,NRAS Q61,PIK3CA E542 E545,PIK3CA H1047)分別進行了外泌體及血細胞DNA的PCR擴增、電泳驗證以及擴增產(chǎn)物的高通量測序分析。與此同時,隨機抽取了30例健康志愿者的血液樣本作為對照,并對其進行外泌體及血細胞中KRAS G12 G13、KRAS Q61、BRAF V600基因位點擴增及二代測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn),外泌體DNA中KRAS基因野生型的患者,在腫瘤組織中同樣為野生型;所有經(jīng)組織學(xué)檢測存在KRAS基因突變的患者在外泌體DNA中也都同樣檢測到了突變,但是對于組織學(xué)檢測KRAS基因為野生型的患者來說,有一部分患者對應(yīng)的外泌體基因檢測卻表現(xiàn)為突變型。上述這種情況在NRAS基因中也有所體現(xiàn)。對于PIK3CA基因來講,三個位點在外泌體DNA中均存在較高比例的突變,特別是E545基因位點,外泌體中的突變率高達92.7%;另外該位點的血細胞DNA也有較高的突變率,其余7個基因位點很少能檢測到血細胞DNA的突變。與PIK3CA基因不同,BRAF V600、KRAS Q61、NRAS Q61在外泌體中的突變率較低,基本與文獻報道一致。而來自健康志愿者的血液樣本中均沒有檢測到相關(guān)基因的突變。上述結(jié)果表明:對于結(jié)直腸癌患者來說,外泌體基因檢測結(jié)果與腫瘤組織基因檢測在某種程度上具有一致性,有可能作為一種潛在的生物標志物應(yīng)用于臨床檢測。既然外泌體中存在基因突變且某些基因的突變比例相對較高,那么在結(jié)直腸癌患者中是否還存在其他的基因也有類似的高突變率;外泌體中的基因突變率是否會在患者臨床治療的過程中發(fā)生變化;是否這種變化可以提前預(yù)知患者對治療的反應(yīng)呢?帶著上述疑問,我們收集了37例具有完整治療過程的晚期結(jié)直腸癌患者在用藥過程中的一系列血液樣本,分別進行了血清外泌體DNA和血細胞DNA的提取。隨后結(jié)合文獻和COSMIC數(shù)據(jù)庫中的大腸癌基因突變情況選取了與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的24個基因30個基因位點分別進行了外泌體及血細胞DNA的PCR擴增、核酸電泳驗證以及高通量測序分析。根據(jù)現(xiàn)階段返回的測序結(jié)果有以下發(fā)現(xiàn),首先,病理組織學(xué)基因檢測明確KRAS基因為野生型的患者在治療過程中血清外泌體DNA會發(fā)生KRAS基因的突變;其次,外泌體DNA中除了第二章中涉及到PIK3CA E545、PIK3CA H1047、KRAS G12 G13等基因位點同樣具有高頻突變以外,MAP2K1 K57基因也具有高頻突變;并且,上述基因的突變率會隨著患者的治療過程不斷發(fā)生改變,而這種變化的出現(xiàn)會早于影像學(xué)可見的改變,甚至早于患者治療過程中腫瘤標志物的變化。因此,利用外泌體中基因的突變情況可能能夠?qū)颊叩闹委熜ЧM行預(yù)判,利用這種變化可以更好地指導(dǎo)臨床治療過程并及時調(diào)整用藥方案,針對患者的全身腫瘤情況實施更為有效的個體化治療。
[Abstract]:Individualized treatment of tumors is based on the pharmacogenomics of the patient, formulating a reasonable treatment plan for each patient to maximize the clinical efficacy and lower toxic and side effects therapy. The premise of individualized treatment is to carry out the pathological gene detection of tumor tissue, but because of the early tumor, It is easy to find that the diagnosis and subsequent treatment of the patients are limited by many reasons. Therefore, it is an important task to find a simple and convenient alternative that is consistent with the gene changes of the tumor tissue. The exocrine (exosomes) is a type of endocytic system that is derived from the endocytic system. A small nanoscale vesicle with a diameter between 30-150nm and a spherical or cup-shaped shape under electron microscopy. It has a stable double layer membrane structure that excrete into the blood flow or other body fluids through exocytosis. Almost all cells in the body can produce exocrine. The exocrine is almost distributed in all bodies in the body. The liquid system is a bridge of intercellular communication. It is found that the number of exocrine bodies in the tumor patients is much higher than that of the healthy people, and the more important is that the external secreting body contains double stranded DNA, and the gene information carried by these DNA is in some degree consistent with the tumor cell DNA. This study aims to explore the serum of patients with colorectal cancer. The relationship between the mutation of DNA and the mutation of the tumor tissue in the secreting body, and then demonstrate the feasibility of the exocrine as a new gene detection method to guide the individualized treatment. Exocrine, if it wants to be the ideal material for gene detection, must have a considerable degree of stability in addition to the convenience of the material. In the first chapter of this article, we focus on the stability of the exocrine. We store the fresh serum samples in 4 degrees C (24h, 72h, 168h); room temperature (6h, 12h, 24h, 48h); -80 degree C under repeated freezing and thawing (1 times, 3 times, 5 times). The fresh separated serum is used as a control, respectively. The serum Exocyst under the above conditions was taken and the remaining serum was retained after the exocrine removal. The protein and DNA in the exocrine and remaining serum were extracted, and the Western blot verification of the TSG101 and CD63 protein of the external secretory specific markers and the PCR amplification and Sanger sequencing of DNA were used to separate the secreting and exocrine D, respectively. The stability of NA is verified. It is found that exocrine DNA is the main source of DNA in serum, and the exocrine can be in a relatively stable state regardless of the environment. The duration of the stable state changes with the change of the storage environment: the exocrine extracted from the serum stored in 4 degree C and its DNA In order to stabilize the stability, the stability can last at least 1 weeks, and at least 1 days at room temperature can be stabilized at room temperature; repeated freezing and thawing the most serious damage to the external secreting body. After 3 times freeze thawing, the exocrine and its DNA in the serum are destroyed. However, the exocrine DNA remains even at room temperature for 48h and even for 5 times of freezing and thawing. PCR amplification and detection of gene mutations consistent with the fresh serum exocrine are performed. The above results not only fully demonstrate the strong stability of the exocrine and exocrine DNA, but also provide a lasting time for the existence of this stability, which provides a reliable guarantee for the exocrine as a new method for detecting tumor genes. In the second chapter of this study, 96 cases of colorectal cancer patients with clear KRAS gene status were collected and the serum exocyts and blood cells DNA were extracted. 6 gene loci closely related to colorectal cancer (KRAS G12 G13, KRAS Q61, BRAF V600, NRAS Q61, PIK3CA E542 E545) were amplified, electrophoretic verification and high throughput sequencing analysis of the amplified products. At the same time, blood samples from 30 healthy volunteers were randomly selected. In contrast, KRAS G12 G13, KRAS Q61, BRAF V600 loci amplification and two generation sequencing were carried out in the exocrine and blood cells. The results showed that the wild type of the KRAS gene in the exocrine DNA was also wild in the tumor tissue, and all the patients with the KRAS gene mutation in all histology tests were also detected in the exocrine DNA. The mutation was found, but for the KRAS gene of the wild type, some of the corresponding exocrine genes were found to be mutated. The above was also reflected in the NRAS gene. For the PIK3CA gene, the three loci had a high proportion of mutations in the exocrine DNA, especially the E545. In the gene locus, the mutation rate in the exocrine is up to 92.7%, and the blood cell DNA of the site also has a high mutation rate, and the other 7 loci rarely detect the mutation of the blood cell DNA. The mutation rate of BRAF V600, KRAS Q61 and NRAS Q61 in the exocrine is lower than that of the PIK3CA gene. The above results show that, for colorectal cancer patients, the exocrine gene detection results are in some degree consistent with the tumor tissue gene detection, and may be used as a potential biomarker for clinical detection. There is a gene process in the exocrine. If the mutation ratio of some genes is relatively high, there is a similar high mutation rate in the other genes in the patients with colorectal cancer; is the mutation rate in the exocrine in the process of the patient's clinical treatment; is this change early to predict the patient's response to the treatment? With the above suspicion We have collected a series of blood samples from 37 patients with advanced colorectal cancer in the process of complete treatment. The extraction of serum Exocyst DNA and blood cell DNA were carried out respectively. Then 24 genes closely related to colorectal cancer were selected in the literature and COSMIC database. The PCR amplification of exocrine and blood cells DNA, nucleic acid electrophoresis and high throughput sequencing analysis were carried out at the loci respectively. According to the results of the sequence returned at this stage, first, the histopathological gene detected that the KRAS gene of the wild type in the course of treatment could produce the KRAS gene in the serum exocrine DNA in the course of treatment. Secondly, in the exocrine DNA, in addition to the second chapters involving PIK3CA E545, PIK3CA H1047, KRAS G12 G13 and other gene loci, the MAP2K1 K57 gene also has a high frequency mutation, and the mutation rate of the above gene changes with the patient's treatment process, and this change will appear earlier than that of the imageology. The changes are even earlier than the changes in the tumor markers during the treatment of the patients. Therefore, the mutation of the genes in the exocrine may be able to prejudge the therapeutic effect of the patient, using this change to better guide the clinical treatment process and to adjust the drug prescription in time. Effective individualized treatment.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

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本文編號：1957391