本文選題：蛛毒基因 + 蠟蚧菌　； 參考：《云南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：蠟蚧菌是重要的蟲(chóng)生真菌,可寄生溫室粉虱、多種蚜蟲(chóng)、薊馬等多種害蟲(chóng),在無(wú)公害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用于防治溫室蔬菜害蟲(chóng),表現(xiàn)出優(yōu)良的的防治效果,但其防效受多種因素的影響并存在一些弱點(diǎn),突出表現(xiàn)為殺蟲(chóng)速度較慢,在害蟲(chóng)數(shù)量發(fā)生較大時(shí),很難迅速壓低蟲(chóng)口數(shù)量。本研究選擇將特異性殺蟲(chóng)的外源的蜘蛛毒素基因?qū)胂烌痪?構(gòu)建工程菌株,改良蠟蚧菌的毒力,并對(duì)其改良效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。主要研究結(jié)果如下:1.刺吸式害蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)寄生菌的分離鑒定:采用單孢分離的方法,對(duì)從感病的粉虱上分離得到的座殼孢進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,對(duì)比實(shí)驗(yàn)室以保存的蠟蚧菌CA-14的生物學(xué)特性及其刺吸式害蟲(chóng)對(duì)寄主的選擇,最終確定以蠟蚧菌為供試材料進(jìn)行毒力改良。2.外源蜘蛛毒素基因的選擇及其人工合成:通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研,在GenBank中對(duì)昆蟲(chóng)相關(guān)毒素基因信息進(jìn)行大量比較,遴選出對(duì)昆蟲(chóng)有特異作用的澳大利亞漏斗網(wǎng)蜘蛛的毒素基因ω-ACTX-Ar1a。利用分子技術(shù)人工合成該基因的編碼區(qū)(委托專業(yè)公司合成),將其連接至載體pUC57質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,利用PCR技術(shù)和抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆子,提取重組質(zhì)粒,以其為模板PCR擴(kuò)增得到大量的毒素基因片段。3.構(gòu)建了毒素基因的ω-ACTX-Ar1a表達(dá)載體:以pBHt2質(zhì)粒為模板克隆真菌的啟動(dòng)子PtrpC,以pAN7-1質(zhì)粒為模板,克隆真菌的啟動(dòng)子PgdpA和終止子TtrpC。利用重疊和降落PCR將目的基因和不同的啟動(dòng)子和終止子連接,構(gòu)建了兩個(gè)重組片段“PtrpC-ω-ACTX-Ar1a”和“PgdpA-ω-ACTX-Ar1a-TtrpC”。通過(guò)對(duì)重組片段和載體pBHt2質(zhì)粒的序列和酶切位點(diǎn)的分析,以KpnI和HindIII為限制性內(nèi)切酶,在T4 DNA連接酶的作用下,將重組片段與經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的pBHt2質(zhì)粒連接,構(gòu)建了重組質(zhì)粒的表達(dá)載體Pω和PωT。4.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化蠟蚧菌:制備農(nóng)桿菌AGL-1的感受態(tài),將重組質(zhì)粒Pω和PωT載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中,利用含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌與蠟蚧菌CA-14共培養(yǎng),在乙酰丁香酮的誘導(dǎo)下,使目的基因隨機(jī)插入蠟蚧菌中。在潮霉素B抗性的篩選下,隨機(jī)挑選100株不同的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行抗性篩選驗(yàn)證和遺傳穩(wěn)定性分析。提取不同轉(zhuǎn)化子的DNA,以DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)目的基因,結(jié)果顯示,66株轉(zhuǎn)化子含有目的基因,轉(zhuǎn)化效率為66%。對(duì)這些轉(zhuǎn)化子在進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析,在不含潮霉素B抗性的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子均能正常生長(zhǎng)。再以這些能正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行RT-PCR轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)20株轉(zhuǎn)化子在RNA水平上成功表達(dá)。對(duì)成功表達(dá)的20株轉(zhuǎn)化子目的基因的拷貝數(shù)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),選擇單拷貝基因NIF3為內(nèi)參基因,得到單拷貝的轉(zhuǎn)化子有8株,多拷貝轉(zhuǎn)化子5株。5.將得到的重組菌株進(jìn)行毒力測(cè)定及其效果評(píng)價(jià):以無(wú)翅的菜縊管蚜為供試?yán)ハx(chóng),以無(wú)菌水(含0.1%的吐溫80),對(duì)轉(zhuǎn)基因菌株和原始的蠟蚧菌進(jìn)行毒力測(cè)定,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因菌株的毒力效果不一,對(duì)蚜蟲(chóng)的致死時(shí)間有不同程度的縮短,其中毒力效果最好的Pω-40和PωT-2的LT50分別為4.615 d和4.517 d,相較于原始菌株的6.824 d縮短了分別縮短了2.209 d和2.307 d。表明導(dǎo)入的外源毒素基因提高了蠟蚧菌的毒力,縮短了害蟲(chóng)致死的時(shí)間。
[Abstract]:The research results are as follows : 1 . Isolation and identification of insect - related toxin genes by using molecular techniques . The results are as follows : 1 . The isolation and identification of insect - related toxin genes is carried out by means of molecular technology . The results are as follows : 1 . The recombinant plasmids are cloned into the vector pBHt2 and the recombinant plasmids are cloned . The recombinant plasmids are ligated to pBHt2 plasmid digested with restriction enzymes . The results of RT - PCR were used to determine the effective expression of NIF3 . The results showed that the virulence of the transgenic strain was shorter than that of the original strain . The results showed that the virulence of the transgenic strain was 4.615 d and 4.517 d , respectively .
【學(xué)位授予單位】：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S476.12

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本文編號(hào)：1942495