本文選題：玉米 + CRISPR-Cas9��； 參考：《安徽農(nóng)業(yè)大學》2016年碩士論文

【摘要】：基因組編輯是一種新近發(fā)展的在受體基因組中人工定向產(chǎn)生插入、刪除和替換等突變的技術(shù)。基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的基因編輯技術(shù)因操作簡便、設(shè)計靈活和突變效率高等特點,成為基因編輯的主流技術(shù),并在玉米等高等植物定向遺傳改良提供了新途徑。然而,玉米中可用于表達sg RNA的polⅢ啟動子未得到系統(tǒng)鑒定,限制了CRISPR-Cas9技術(shù)在玉米中的應用。本研究擬建立一套玉米瞬時表達系統(tǒng),用以系統(tǒng)評估玉米多個RNA polⅢ啟動子在CRISPR-Cas9技術(shù)系統(tǒng)中的活性,為高效玉米基因編輯技術(shù)體系提供關(guān)鍵遺傳元件,并基于鑒定的高活性的RNA polⅢ啟動子建立了玉米CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)體系,應用于玉米ZmWaxy1基因的基因敲除編輯。主要研究結(jié)果如下:(1)建立了一套穩(wěn)定高效的玉米瞬時表達系統(tǒng)。以鄭58、B73、中單99、自交系Black Mexican Sweet(BMS)等品種(系)的二葉期葉片為材料,采用酶解法進行了玉米葉肉細胞原生質(zhì)體制備,獲得的原生質(zhì)體細胞通過FDA染色鏡檢,結(jié)果表明,基于本技術(shù)體系可以高效制備鄭58、B73、中單99、自交系Black Mexican Sweet(BMS)等品種的高活性葉肉細胞原生質(zhì)體。通過對PEG介導的外源表達Ds Red-2標記基因表達載體試驗對PEG濃度等參數(shù)進行了優(yōu)化,結(jié)果表明,最佳轉(zhuǎn)化效率的PEG濃度為45%。本研究建立了轉(zhuǎn)化效率高達80%的玉米葉肉細胞原生質(zhì)體的技術(shù)體系。(2)建立了高效的CRISPR-Cas9基因編輯離體The Traffic Light Reporter(TLR)報告系統(tǒng)。本研究中TLR報告系統(tǒng)設(shè)計由兩個串聯(lián)的移碼突變的e GFP和Ds Red報告基因,依據(jù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)特點在設(shè)計的TLR系統(tǒng)前加入一段CRISPR-Cas9系統(tǒng)識別序列作為突變位點。在原生質(zhì)體中當TLR系統(tǒng)被CRISPR-Cas9編輯后,引入的突變可以分別引起移碼e GFP和Ds Red報告基因回復突變,并分別在胞內(nèi)顯示綠色與紅色熒光,從而流式細胞計數(shù)統(tǒng)計突變率。(3)玉米RNA PolⅢ啟動子分離及其CRISPR-Cas9活性鑒定。于玉米全基因組中搜尋U6 sn RNA所在物理位置,取基因上游400-500 bp為U6 sn RNA潛在的啟動子序列,通過比對篩選我們共找到6個潛在的玉米U6 sn RNA啟動子。采用PCR法成功分離這6個預測的啟動子,并基于本研究建立的高效瞬時表達系統(tǒng)與離體的TLR報告系統(tǒng),鑒定了這些啟動子的CRISPR-Cas9活性,鑒定出玉米中高活性的RNA PolⅢ啟動子,并用于CRISPR-Cas9后續(xù)試驗。(4)以ZmWaxy1基因為基因編輯的目標基因,選擇該基因ZmWaxy1基因的第7外顯子上構(gòu)建了人工定向編輯CRISPR-Cas9載體。(5)ZmWaxy1基因敲除基因編輯。通過農(nóng)桿菌介導法,對玉米進行CRISPR-Cas9基因編輯載體的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。采用PCR法篩選得到36個穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系,通過對T0代植株測序并對靶基因目標區(qū)域進行了基因突變分析統(tǒng)計,結(jié)果表明,36株轉(zhuǎn)基因植株中,純合突變?yōu)?3株,雙等位基因突變12株,雜合突變0株,野生型1株,突變率為97.22%。將T0代與野生型植株進行雜交得到T1代籽粒,所得到的籽粒經(jīng)過碘染色大部分表現(xiàn)出糯性性狀特性,表明CRISPR-Cas9在子代中表現(xiàn)出了較高的編輯效率。T0、T1代籽粒胚乳淀粉粒與花粉經(jīng)過固定后進行碘染色通過顯微鏡觀察表明,糯性性狀表型可靠,且遺傳穩(wěn)定。結(jié)果表明,本研究建立了玉米CRISPR-Cas9高效基因敲除編輯技術(shù)體系。
[Abstract]:In this study , we have established a system for gene editing of maize leaf - meat cells with high efficiency . The results show that the gene - editing technology of maize leaf - meat cells is based on the characteristics of simple operation , flexibility and high mutation efficiency . ( 3 ) The expression of CRISPR - Cas9 in maize was determined by PCR . The results showed that the expression of CRISPR - Cas9 gene was higher than that of wild - type plants .
【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S513

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 Chao Feng;Jing Yuan;Rui Wang;Yang Liu;James A.Birchler;Fangpu Han;;Efficient Targeted Genome Modification in Maize Using CRISPR/Cas9 System[J];Journal of Genetics and Genomics;2016年01期

2 Jinjie Zhu;Ning Song;Silong Sun;Weilong Yang;Haiming Zhao;Weibin Song;Jinsheng Lai;;Efficiency and Inheritance of Targeted Mutagenesis in Maize Using CRISPR-Cas9[J];Journal of Genetics and Genomics;2016年01期

3 Zhen Liang;Kang Zhang;Kunling Chen;Caixia Gao;;Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J];Journal of Genetics and Genomics;2014年02期

4 肖安;胡瑩瑩;王唯曄;楊志們;王展翔;黃鵬;佟向軍;張博;林碩;;人工鋅指核酸酶介導的基因組定點修飾技術(shù)[J];遺傳;2011年07期

，

本文編號：1941046