本文選題：玉米 + CRISPR-Cas9　； 參考：《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：基因組編輯是一種新近發(fā)展的在受體基因組中人工定向產(chǎn)生插入、刪除和替換等突變的技術(shù)。基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的基因編輯技術(shù)因操作簡(jiǎn)便、設(shè)計(jì)靈活和突變效率高等特點(diǎn),成為基因編輯的主流技術(shù),并在玉米等高等植物定向遺傳改良提供了新途徑。然而,玉米中可用于表達(dá)sg RNA的polⅢ啟動(dòng)子未得到系統(tǒng)鑒定,限制了CRISPR-Cas9技術(shù)在玉米中的應(yīng)用。本研究擬建立一套玉米瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),用以系統(tǒng)評(píng)估玉米多個(gè)RNA polⅢ啟動(dòng)子在CRISPR-Cas9技術(shù)系統(tǒng)中的活性,為高效玉米基因編輯技術(shù)體系提供關(guān)鍵遺傳元件,并基于鑒定的高活性的RNA polⅢ啟動(dòng)子建立了玉米CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)體系,應(yīng)用于玉米ZmWaxy1基因的基因敲除編輯。主要研究結(jié)果如下:(1)建立了一套穩(wěn)定高效的玉米瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。以鄭58、B73、中單99、自交系Black Mexican Sweet(BMS)等品種(系)的二葉期葉片為材料,采用酶解法進(jìn)行了玉米葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體制備,獲得的原生質(zhì)體細(xì)胞通過(guò)FDA染色鏡檢,結(jié)果表明,基于本技術(shù)體系可以高效制備鄭58、B73、中單99、自交系Black Mexican Sweet(BMS)等品種的高活性葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體。通過(guò)對(duì)PEG介導(dǎo)的外源表達(dá)Ds Red-2標(biāo)記基因表達(dá)載體試驗(yàn)對(duì)PEG濃度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明,最佳轉(zhuǎn)化效率的PEG濃度為45%。本研究建立了轉(zhuǎn)化效率高達(dá)80%的玉米葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的技術(shù)體系。(2)建立了高效的CRISPR-Cas9基因編輯離體The Traffic Light Reporter(TLR)報(bào)告系統(tǒng)。本研究中TLR報(bào)告系統(tǒng)設(shè)計(jì)由兩個(gè)串聯(lián)的移碼突變的e GFP和Ds Red報(bào)告基因,依據(jù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)特點(diǎn)在設(shè)計(jì)的TLR系統(tǒng)前加入一段CRISPR-Cas9系統(tǒng)識(shí)別序列作為突變位點(diǎn)。在原生質(zhì)體中當(dāng)TLR系統(tǒng)被CRISPR-Cas9編輯后,引入的突變可以分別引起移碼e GFP和Ds Red報(bào)告基因回復(fù)突變,并分別在胞內(nèi)顯示綠色與紅色熒光,從而流式細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)突變率。(3)玉米R(shí)NA PolⅢ啟動(dòng)子分離及其CRISPR-Cas9活性鑒定。于玉米全基因組中搜尋U6 sn RNA所在物理位置,取基因上游400-500 bp為U6 sn RNA潛在的啟動(dòng)子序列,通過(guò)比對(duì)篩選我們共找到6個(gè)潛在的玉米U6 sn RNA啟動(dòng)子。采用PCR法成功分離這6個(gè)預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子,并基于本研究建立的高效瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)與離體的TLR報(bào)告系統(tǒng),鑒定了這些啟動(dòng)子的CRISPR-Cas9活性,鑒定出玉米中高活性的RNA PolⅢ啟動(dòng)子,并用于CRISPR-Cas9后續(xù)試驗(yàn)。(4)以ZmWaxy1基因?yàn)榛蚓庉嫷哪繕?biāo)基因,選擇該基因ZmWaxy1基因的第7外顯子上構(gòu)建了人工定向編輯CRISPR-Cas9載體。(5)ZmWaxy1基因敲除基因編輯。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,對(duì)玉米進(jìn)行CRISPR-Cas9基因編輯載體的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。采用PCR法篩選得到36個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系,通過(guò)對(duì)T0代植株測(cè)序并對(duì)靶基因目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行了基因突變分析統(tǒng)計(jì),結(jié)果表明,36株轉(zhuǎn)基因植株中,純合突變?yōu)?3株,雙等位基因突變12株,雜合突變0株,野生型1株,突變率為97.22%。將T0代與野生型植株進(jìn)行雜交得到T1代籽粒,所得到的籽粒經(jīng)過(guò)碘染色大部分表現(xiàn)出糯性性狀特性,表明CRISPR-Cas9在子代中表現(xiàn)出了較高的編輯效率。T0、T1代籽粒胚乳淀粉粒與花粉經(jīng)過(guò)固定后進(jìn)行碘染色通過(guò)顯微鏡觀察表明,糯性性狀表型可靠,且遺傳穩(wěn)定。結(jié)果表明,本研究建立了玉米CRISPR-Cas9高效基因敲除編輯技術(shù)體系。
[Abstract]:In this study , we have established a system for gene editing of maize leaf - meat cells with high efficiency . The results show that the gene - editing technology of maize leaf - meat cells is based on the characteristics of simple operation , flexibility and high mutation efficiency . ( 3 ) The expression of CRISPR - Cas9 in maize was determined by PCR . The results showed that the expression of CRISPR - Cas9 gene was higher than that of wild - type plants .
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2;S513

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1941046