本文選題：牛分枝桿菌 + MPB83-70融合蛋白基因��； 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：實驗?zāi)康?牛結(jié)核病是一種能夠嚴(yán)重威脅到人類的食品健康安全及經(jīng)濟安全的人獸共患傳染病,近幾年來疫情蔓延迅速,發(fā)病率逐年增長。目前,唯一可用牛結(jié)病疫苗仍然是卡介苗(BCG),但由于對牛群的免疫效果不理想,因此,研究者們正極力研制出高效的牛結(jié)核病疫苗。MPB83、MPB70是牛分枝桿菌早期分泌蛋白,也是目前研究最多的蛋白。將MPB83、MPB70蛋白基因融合在一起,可以在很大程度上提高對于牛結(jié)核病的防御效果,作為診斷性抗原時,具有很高的特異性和靈敏度。因此,將MPB83-70融合基因作為本實驗的靶基因?qū)ρ邪l(fā)牛結(jié)核病疫苗具有深遠意義。乳酸乳球菌pNZ8149/NZ3900被稱為食品安全級微生物,又是腸道益生菌,其抗原性較弱、不產(chǎn)生胞外酶,篩選時無需抗生素篩選標(biāo)記,是疫苗研發(fā)中天然的遞呈外源抗原載體,已成為疫苗研發(fā)、生物制藥等領(lǐng)域的研究熱點。因此,本文將以pNZ8149/NZ3900作為表達載體,表達牛分枝桿菌MPB83-70融合基因,以構(gòu)建出重組乳酸乳球菌,并對該重組菌的免疫指標(biāo)進行測定,為制備牛結(jié)核病疫苗提供理論參考。試驗方法:以質(zhì)粒mpb83-70x作為PCR模板,對目的基因mpb83-70進行PCR擴增并與pMD18-T Simple Vector進行連接,構(gòu)建出克隆質(zhì)粒pMD18-T(S)-mpb83-70。將其用KpnⅠ、NcoⅠ進行酶切,回收得到的目的基因mpb83-70與表達載體pNZ8149/NZ3900進行連接,以電擊轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入到乳酸菌感受態(tài)內(nèi),涂于含乳糖及溴甲酚紫的ELLKEI固體篩選培養(yǎng)基上,長出的黃色菌落初步判定為陽性菌pNZ8149-83-70/NZ3900。經(jīng)Nisin誘導(dǎo),SDS-PAGE及間接免疫熒光鑒定,乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900表達37kDa mpb83-70目的蛋白。隨后,將pNZ8149-83-70/NZ3900重組乳酸菌免疫小鼠,利用流式細胞術(shù)對免疫小鼠的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞以及IL-2、TNF-α、IFN-γ細胞因子數(shù)量進行檢測,再應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)以及Mouse sIgA ELISA Kit試劑盒檢測免疫小鼠血清內(nèi)的特異性IgG和糞便上清液中sIgA水平,最后利用統(tǒng)計學(xué)分析方法對得到的數(shù)據(jù)概括分析。實驗結(jié)果:1、通過PCR技術(shù),成功擴增出目的基因mpb83-70,與大腸桿菌克隆載體pMD18-T Simple Vector進行連接,酶切回收后得到了mpb83-70克隆基因;2、目的基因mpb83-70與表達載體pNZ8149/NZ3900連接后經(jīng)過雙酶切鑒定,成功構(gòu)建了重組乳酸菌pNZ8149-83-70/NZ3900。經(jīng)SDS-PAGE及間接免疫熒光驗證,重組乳酸菌表達37kDa的外源蛋白;3、利用流式細胞儀檢測免疫小鼠體內(nèi)CD3+T淋巴細胞的數(shù)目高于空載pNZ8149組和0.9%NaCl組,但低于BCG組。四組之間差異均不顯著(P0.05)。免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的CD4+T淋巴細胞的數(shù)目略低于BCG組但差異并不顯著(P0.05),與空載pNZ8149/NZ3900組和PBS組相比較,重組乳酸菌產(chǎn)生的CD4+T淋巴細胞數(shù)目較高且差異顯著(P0.05)。CD8+T淋巴細胞數(shù)量略低于BCG組差異不顯著(P0.05),但高于空載pNZ8149/NZ3900組和PBS組且差異顯著(P0.05)。流式細胞儀檢測免疫小鼠淋巴細胞產(chǎn)生IL-2的細胞數(shù)量高于BCG組及空載pNZ8149/NZ3900組,但差異不顯著(P0.05),BCG組數(shù)值高于空載pNZ8149/NZ3900組及PBS組,但差異不顯著(P0.05)。產(chǎn)生IFN-γ的細胞數(shù)小于BCG組且差異不顯著(P0.05),但同其他兩組對比數(shù)值偏高且差異不顯著(P0.05)。分泌TNF-α的細胞數(shù)小于BCG組,高于pNZ8149/NZ3900組及PBS組,且差異都不顯著(P0.05)。應(yīng)用ELISA對免疫小鼠血清中IgG抗體進行檢驗,結(jié)果表明重組乳酸菌pNZ8149-83-70/NZ3900組數(shù)值低于BCG組,高于空載pNZ8149/NZ3900組及PBS組,且差異都不顯著(P0.05)。利用Mouse sIgA ELISA Kit檢驗免疫小鼠糞便內(nèi)sIgA抗體水平,結(jié)果表明:pNZ8149-83-70/NZ3900組數(shù)值高于BCG組、空載pNZ8149/NZ3900組及PBS組且差異顯著(P0.05),由此可以證實pNZ8149-83-70/NZ3900可以引起局部黏膜免疫應(yīng)答反應(yīng),并能夠誘發(fā)免疫小鼠產(chǎn)生較好的sIgA抗體。綜上所述,流式試驗及ELISA試驗統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示出重組乳酸乳球菌pNZ8149-83-70/NZ3900具有免疫原性,可以為牛結(jié)核病疫苗的后續(xù)研究提供理論依據(jù)。
[Abstract]:In this paper , the fusion gene of MPB83 - 70 ( MPB83 - 70 ) was used as the expression vector to construct the recombinant plasmid pMD18 - T ( S ) - mpb83 - 70 . The recombinant strain MPB83 - 70 was used as an expression vector to construct the recombinant plasmid pMD18 - T ( S ) - mpb83 - 70 . IFN-緯緇嗚優(yōu)鍥犲瓙鏁伴噺榪涜媯，

本文編號：1940813