本文選題：CRISPR/Cas技術(shù) + 轉(zhuǎn)基因�。� 參考：《中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志》2017年01期

【摘要】：目的探討含瘦素(leptin)蛋白轉(zhuǎn)基因約氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium yoelli)對(duì)感染小鼠體質(zhì)量的影響。方法設(shè)計(jì)并構(gòu)建含小鼠瘦素基因的瘧原蟲(chóng)CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒,該質(zhì)粒兩端帶有約氏瘧原蟲(chóng)17XNL株巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)的5′和3′同源序列,將外源的小鼠瘦素基因經(jīng)同源重組插入至MIF基因編碼區(qū)下游,構(gòu)建重組質(zhì)粒PYC-MIF-Leptin。將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的約氏瘧原蟲(chóng)成熟裂殖體內(nèi),通過(guò)尾靜脈注射該裂殖體感染雌性昆明小鼠1只,經(jīng)乙胺嘧啶篩選和PCR鑒定獲得轉(zhuǎn)基因約氏瘧原蟲(chóng)克隆。將轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng)和野生型瘧原蟲(chóng)感染C57BL/6小鼠各1只,取眼球血和尾靜脈血,通過(guò)RTPCR和免疫熒光檢測(cè)瘦素在瘧原蟲(chóng)內(nèi)是否成功表達(dá)。將含轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng)和野生型瘧原蟲(chóng)(1×104接種量)的200μl PBS尾靜脈注射感染C57BL/6小鼠各5只,陰性對(duì)照組注射等量PBS。每?jī)商煊涗洸⒔y(tǒng)計(jì)小鼠原蟲(chóng)血癥及體質(zhì)量變化。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果構(gòu)建了含瘦素基因和瘧原蟲(chóng)MIF同源重組序列的重組質(zhì)粒PYC-MIF-Leptin。轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng)DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí),瘦素基因整合入MIF基因下游,并在瘧原蟲(chóng)中成功轉(zhuǎn)錄。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng)能夠表達(dá)小鼠瘦素蛋白。轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng)組17 d體質(zhì)量下降尤其明顯,為(17.26±1.40)g。野生型瘧原蟲(chóng)組和陰性對(duì)照組小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化,而轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng)組體質(zhì)量下降達(dá)10.7%(P0.05)。兩種瘧原蟲(chóng)都在原蟲(chóng)血癥達(dá)到10%左右時(shí)開(kāi)始下降,但是轉(zhuǎn)基因瘧原蟲(chóng)增殖速度較快,最終在23 d左右均消失。結(jié)論表達(dá)瘦素基因的轉(zhuǎn)基因約氏瘧原蟲(chóng)可降低感染小鼠的體質(zhì)量。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of Plasmodium yoellii (Plasmodium yoellii) on the body mass of infected mice. Methods the recombinant plasmids of Plasmodium CRISPR/Cas9 containing mouse leptin gene were designed and constructed. The recombinant plasmids contained 5 'and 3' homologous sequences of macrophage migration inhibitory factor-MIF, a macrophage migration inhibitor of Plasmodium yoelii 17XNL strain. The recombinant plasmid PYC-MIF-Leptin was constructed by inserting the exogenous mouse leptin gene into the downstream of MIF gene coding region. The recombinant plasmids were transfected into mature Plasmodium yoelii cultured in vitro. One female Kunming mouse was infected with the recombinant plasmid by tail vein injection. The cloned plasmodium yoelii was obtained by ethylamine screening and PCR identification. C57BL/6 mice were infected with transgenic Plasmodium falciparum and wild-type Plasmodium falciparum respectively. Eyeball blood and caudal vein blood were collected. Leptin expression in Plasmodium was detected by RTPCR and immunofluorescence. Two hundred 渭 l PBS containing 1 脳 10 ~ 4 transgenic plasmodium and wild plasmodium were injected intravenously into C57BL/6 mice, and the negative control group were injected with the same amount of PBSs. The changes of protozoemia and body mass of mice were recorded and counted every two days. SPSS 19.0 software was used for statistical analysis. Results the recombinant plasmid PYC-MIF-Leptin containing leptin gene and plasmodium MIF homologous recombination sequence was constructed. The DNA sequencing of the transgenic plasmodium confirmed that leptin gene was integrated into the downstream of MIF gene and successfully transcribed in Plasmodium falciparum. Immunofluorescence assay showed that the transgenic plasmodium could express leptin protein in mice. The body weight of transgenic plasmodium group was 17.26 鹵1.40g. There was no significant difference in body mass between wild type malaria parasite group and negative control group, but the body weight of transgenic malaria parasite group decreased to 10.7% (P 0.05). The two plasmodium species began to decrease when the parasitemia reached about 10%, but the growth rate of the transgenic plasmodium was faster, and finally disappeared at about 23 days. Conclusion the transgenic plasmodium yoelii expressing leptin gene can reduce the body mass of infected mice.
【作者單位】： 第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病原生物教研室;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81471976)~~
【分類號(hào)】：R382.31

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本文編號(hào)：1935179