本文選題：CRISPR/Cas技術 + 轉(zhuǎn)基因�。� 參考：《中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志》2017年01期

【摘要】：目的探討含瘦素(leptin)蛋白轉(zhuǎn)基因約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelli)對感染小鼠體質(zhì)量的影響。方法設計并構(gòu)建含小鼠瘦素基因的瘧原蟲CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒,該質(zhì)粒兩端帶有約氏瘧原蟲17XNL株巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)的5′和3′同源序列,將外源的小鼠瘦素基因經(jīng)同源重組插入至MIF基因編碼區(qū)下游,構(gòu)建重組質(zhì)粒PYC-MIF-Leptin。將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的約氏瘧原蟲成熟裂殖體內(nèi),通過尾靜脈注射該裂殖體感染雌性昆明小鼠1只,經(jīng)乙胺嘧啶篩選和PCR鑒定獲得轉(zhuǎn)基因約氏瘧原蟲克隆。將轉(zhuǎn)基因瘧原蟲和野生型瘧原蟲感染C57BL/6小鼠各1只,取眼球血和尾靜脈血,通過RTPCR和免疫熒光檢測瘦素在瘧原蟲內(nèi)是否成功表達。將含轉(zhuǎn)基因瘧原蟲和野生型瘧原蟲(1×104接種量)的200μl PBS尾靜脈注射感染C57BL/6小鼠各5只,陰性對照組注射等量PBS。每兩天記錄并統(tǒng)計小鼠原蟲血癥及體質(zhì)量變化。采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果構(gòu)建了含瘦素基因和瘧原蟲MIF同源重組序列的重組質(zhì)粒PYC-MIF-Leptin。轉(zhuǎn)基因瘧原蟲DNA測序結(jié)果證實,瘦素基因整合入MIF基因下游,并在瘧原蟲中成功轉(zhuǎn)錄。免疫熒光實驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因瘧原蟲能夠表達小鼠瘦素蛋白。轉(zhuǎn)基因瘧原蟲組17 d體質(zhì)量下降尤其明顯,為(17.26±1.40)g。野生型瘧原蟲組和陰性對照組小鼠體質(zhì)量無明顯變化,而轉(zhuǎn)基因瘧原蟲組體質(zhì)量下降達10.7%(P0.05)。兩種瘧原蟲都在原蟲血癥達到10%左右時開始下降,但是轉(zhuǎn)基因瘧原蟲增殖速度較快,最終在23 d左右均消失。結(jié)論表達瘦素基因的轉(zhuǎn)基因約氏瘧原蟲可降低感染小鼠的體質(zhì)量。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of Plasmodium yoellii (Plasmodium yoellii) on the body mass of infected mice. Methods the recombinant plasmids of Plasmodium CRISPR/Cas9 containing mouse leptin gene were designed and constructed. The recombinant plasmids contained 5 'and 3' homologous sequences of macrophage migration inhibitory factor-MIF, a macrophage migration inhibitor of Plasmodium yoelii 17XNL strain. The recombinant plasmid PYC-MIF-Leptin was constructed by inserting the exogenous mouse leptin gene into the downstream of MIF gene coding region. The recombinant plasmids were transfected into mature Plasmodium yoelii cultured in vitro. One female Kunming mouse was infected with the recombinant plasmid by tail vein injection. The cloned plasmodium yoelii was obtained by ethylamine screening and PCR identification. C57BL/6 mice were infected with transgenic Plasmodium falciparum and wild-type Plasmodium falciparum respectively. Eyeball blood and caudal vein blood were collected. Leptin expression in Plasmodium was detected by RTPCR and immunofluorescence. Two hundred 渭 l PBS containing 1 脳 10 ~ 4 transgenic plasmodium and wild plasmodium were injected intravenously into C57BL/6 mice, and the negative control group were injected with the same amount of PBSs. The changes of protozoemia and body mass of mice were recorded and counted every two days. SPSS 19.0 software was used for statistical analysis. Results the recombinant plasmid PYC-MIF-Leptin containing leptin gene and plasmodium MIF homologous recombination sequence was constructed. The DNA sequencing of the transgenic plasmodium confirmed that leptin gene was integrated into the downstream of MIF gene and successfully transcribed in Plasmodium falciparum. Immunofluorescence assay showed that the transgenic plasmodium could express leptin protein in mice. The body weight of transgenic plasmodium group was 17.26 鹵1.40g. There was no significant difference in body mass between wild type malaria parasite group and negative control group, but the body weight of transgenic malaria parasite group decreased to 10.7% (P 0.05). The two plasmodium species began to decrease when the parasitemia reached about 10%, but the growth rate of the transgenic plasmodium was faster, and finally disappeared at about 23 days. Conclusion the transgenic plasmodium yoelii expressing leptin gene can reduce the body mass of infected mice.
【作者單位】： 第三軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學部病原生物教研室;
【基金】：國家自然科學基金(No.81471976)~~
【分類號】：R382.31

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本文編號：1935179