發(fā)布時(shí)間：2018-05-25 23:09

  本文選題：海七鰓鰻 + 東北七鰓鰻��； 參考：《上海海洋大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：七鰓鰻是現(xiàn)存最古老的無(wú)頜類脊椎動(dòng)物之一,是聯(lián)系無(wú)脊椎動(dòng)物與脊椎動(dòng)物之間的重要橋梁,對(duì)其免疫系統(tǒng)的研究在理論上有著重要的進(jìn)化意義。海七鰓鰻(Petromyzon marinus)作為典型代表之一,其全基因組測(cè)序已經(jīng)完成,東北七鰓鰻(Lethenteron morii)是分布在我國(guó)東北部的與之親緣關(guān)系接近的主要物種之一。CXCL8(白細(xì)胞介素-8,Interleukin 8)是一種促炎性趨化因子。研究發(fā)現(xiàn)人的CXCL8能促進(jìn)炎性反應(yīng)進(jìn)程、刺激血管的發(fā)生、調(diào)節(jié)宿主免疫功能等,在天然免疫中CXCL8通過(guò)與其受體CXCR1結(jié)合發(fā)揮趨化作用。本研究從海七鰓鰻和東北七鰓鰻中發(fā)現(xiàn)并鑒定出與其他物種具有同源性的CXCL8,分別命名為PmCXCL8和LmCXCL8,其受體CXCR1,分別命名為PmCXCR1和LmCXCR1。在此基礎(chǔ)上,調(diào)查了LmCXCL8和LmCXCR1在東北七鰓鰻體內(nèi)的表達(dá)情況,摸索了LmCXCL8蛋白的原核表達(dá)情況,并利用其重組蛋白驗(yàn)證了其趨化功能。最后利用鈣流實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證了LmCXCL8與LmCXCR1受體的相互關(guān)系。首先我們克隆了海七鰓鰻的CXCL8基因(Pmcxcl8),其開放閱讀框(open reading frame,ORF)為309 nt,該基因編碼102個(gè)氨基酸,分子量為11.23 kDa,等電點(diǎn)為9.37,最大疏水指數(shù)為4.500,最小疏水指數(shù)為-4.500。PmCXCL8氨基酸序列中保守的C36和C38之間插入一個(gè)氨基酸殘基,為CXC型趨化因子,而且不含ELR(Gly-Gly-Arg)基序,相應(yīng)位置被GGR(Gly-Gly-Arg)所替代。原核表達(dá)對(duì)比發(fā)現(xiàn),該蛋白在E.coli Rosetta(DE3)中的表達(dá)優(yōu)于E.coli BL21,最后通過(guò)親和層析法純化得到了高純度的PmCXCL8重組蛋白。SDS-PAGE電泳檢測(cè)和Western blot鑒定結(jié)果條帶單一,分子量正確,表明我們已成功表達(dá)出可溶性良好的PmCXCL8重組蛋白,這為該蛋白功能的研究與抗體的制備提供了實(shí)驗(yàn)材料,也為七鰓鰻天然免疫系統(tǒng)進(jìn)化的研究奠定了基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上,我們又克隆了東北七鰓鰻的CXCL8基因(Lmcxcl8),其cDNA全長(zhǎng)為1055 nt,包含長(zhǎng)為142 nt的5’-非翻譯區(qū)與長(zhǎng)為604 nt的3’-非翻譯區(qū),以及309 nt的開放閱讀框(ORF),編碼102個(gè)氨基酸,蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)在CXC結(jié)構(gòu)前為GGR基序,而非典型的ELR基序。Q-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),LmCXCL8在東北七鰓鰻中屬于組成型表達(dá),在鰓、腸、腎、SN等免疫器官里有較高的表達(dá),且能被銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)刺激誘導(dǎo)表達(dá),證明LmCXCL8參與東北七鰓鰻天然免疫反應(yīng)。通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組蛋白LmCXCL8對(duì)東北七鰓鰻外周血白細(xì)胞有明顯的趨化作用,而PBS陰性對(duì)照及阻斷抗體都沒(méi)有趨化反應(yīng),證明LmCXCL8具有特異性的趨化作用。我們的結(jié)果表明,首次發(fā)現(xiàn)了在無(wú)頜類脊椎動(dòng)物中由自身的趨化因子引起的趨化反應(yīng)。接著,我們克隆了海七鰓鰻和東北七鰓鰻的受體Pmcxcr1和Lmcxcr1基因,它們的ORF開放閱讀框均為1088 nt,編碼360個(gè)氨基酸,LmCXCR1與PmCXCR1氨基酸序列一致性分別為95.83%,為七次跨膜蛋白。Q-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LmCXCR1在東北七鰓鰻中屬于組成型表達(dá),在免疫器官里有較高的表達(dá),且能被銅綠假單胞菌刺激誘導(dǎo)表達(dá),證明LmCXCR1參與東北七鰓鰻天然免疫反應(yīng)。通過(guò)LmCXCR1受體在HEK293T細(xì)胞上表達(dá),經(jīng)鈣流實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了東北七鰓鰻的CXCR1可能為CXCL8的受體。本課題為探索CXCL8與其可能的受體CXCR1的功能和進(jìn)化提供了有力依據(jù),同時(shí)為進(jìn)一步研究天然免疫的進(jìn)化提供了參考。
[Abstract]:A CXCL8 gene ( Pmcxcl8 ) , which has homology to other species , has been identified and identified in E . coli Rosetta ( DE3 ) . In this paper , we found that LmCXCL8 is a constitutive expression in Lampetra japonica . The results show that LmCXCL8 is a constitutive expression in the immune organs such as gill , intestine , kidney , SN and so on .
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：1935006