本文選題：遺傳性痙攣性截癱 + SLC33A1��； 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：遺傳性痙攣性截癱(Hereditary spastic paraplegia,HSP)是一種在臨床上較為罕見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,具有明顯的遺傳和臨床異質(zhì)性。其主要臨床癥狀為對稱性雙側(cè)下肢漸進(jìn)性肌無力和肌張力增高。病理學(xué)變化包括軸索變性和脫髓鞘,并可伴有神經(jīng)元缺失等改變。有關(guān)HSP的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,因此確定HSP的致病基因并對其功能進(jìn)行研究就成為探索HSP發(fā)病機(jī)制及防治的關(guān)鍵。截至目前,已有70余個(gè)HSP致病基因位點(diǎn)和59個(gè)致病基因被確定。其中,SPG42致病基因SLC33A1是由本課題組利用連鎖分析的方法從一例青島地區(qū)HSP家系中發(fā)現(xiàn)的。通過突變分析發(fā)現(xiàn)該家系患者SLC33A1基因第339位胸腺嘧啶突變?yōu)轼B嘌呤,引起SLC33A1蛋白第113位絲氨酸被精氨酸替代,此種錯(cuò)義突變導(dǎo)致HSP發(fā)病。為了更加有效的研究SLC33A1基因錯(cuò)義突變引起遺傳性痙攣性截癱的作用機(jī)制,本課題小組構(gòu)建Slc33a1S113R錯(cuò)義突變(Slc33a1S113R)基因敲入小鼠模型。前期研究發(fā)現(xiàn),雜合子小鼠(Slc33a1wt/mut)能正常存活,而純合子小鼠(Slc33a1wt/wt)在胚胎發(fā)育早期便死亡。這表明SLC33A1蛋白對Slc33a1S113R基因敲入小鼠早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要。此外,我們對Slc33a1wt/mut突變小鼠脊髓灰質(zhì)區(qū)進(jìn)行透射電鏡檢查,結(jié)果顯示Slc33a1wt/mut突變小鼠神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)異常,出現(xiàn)退行性病變。尤其是線粒體,出現(xiàn)腫脹、局部空化、嵴缺失等形態(tài)異常。上述結(jié)論提示我們Slc33a1基因?qū)�粒體的形態(tài)及功能維持具有重要作用。因此,我們利用SPG42患者及對照正常人的皮膚成纖維細(xì)胞,高表達(dá)野生型及突變Slc33a1的HeLa細(xì)胞,體外培養(yǎng)野生型和Slc33a1S113R基因敲入小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞,研究Slc33a1S113R錯(cuò)義突變對線粒體表型的影響,并對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)的"動(dòng)力工廠",是機(jī)體內(nèi)最主要的能量供應(yīng)者,可以為體內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞正常生命活動(dòng)持續(xù)穩(wěn)定的提供能量,因此確保線粒體結(jié)構(gòu)和功能正常對神經(jīng)元存活至關(guān)重要。線粒體多呈短棒狀、粒狀或者線狀,而Slc33a1wt/mut突變小鼠脊髓灰質(zhì)區(qū)透射電鏡結(jié)果顯示神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中線粒體出現(xiàn)腫脹、局部空化和嵴缺失等形態(tài)異常。另外,從體外細(xì)胞水平上,對培養(yǎng)6天的小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行軸突特異性標(biāo)記物Tau蛋白免疫熒光染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Slc33a1wt/mut突變小鼠大腦皮層神經(jīng)元部分軸突發(fā)生腫脹。同時(shí)向大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染線粒體表達(dá)載體pDsRed2-Mito,觀察發(fā)現(xiàn)Slc33a/mut突變小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞中部分軸突腫脹是由于線粒體堆積造成的。隨后,對兩種基因型神經(jīng)元細(xì)胞軸突中線粒體運(yùn)輸能力進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)Slc33a1wt/mut突變小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞線粒體的運(yùn)輸能力出現(xiàn)了明顯下降,這說明Slc33a1S113R錯(cuò)義突變對線粒體的影響在單細(xì)胞水平就能發(fā)生,并且是影響線粒體在神經(jīng)元軸漿中的運(yùn)輸,造成了線粒體的堆積,進(jìn)而影響線粒體對神經(jīng)元細(xì)胞的能量供應(yīng)。但是通過大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞a-Tubulin免疫熒光染色,并未發(fā)現(xiàn)二者的細(xì)胞骨架有明顯異常。說明Slc33a1S113R錯(cuò)義突變不是通過影響細(xì)胞骨架進(jìn)而影響軸漿運(yùn)輸?shù)�。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們向小鼠腓腸肌注射霍亂毒素B亞單位(Cholera Toxin B Subunit.CTB),對小鼠體內(nèi)逆行軸漿運(yùn)輸能力進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Slc33a1wt/mut突變小鼠軸漿內(nèi)物質(zhì)逆行性運(yùn)輸出現(xiàn)異常。此外,我們利用JC-1熒光探針檢測了不同基因型細(xì)胞的線粒體膜電位水平。發(fā)現(xiàn)與對照組相比,Slc33a1wt/mut突變小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞和SPG42患者皮膚成纖維細(xì)胞中線粒體膜電位水平明顯低于對照組,證明了Slc33a1S113R錯(cuò)義突變能夠?qū)е戮�粒體功能發(fā)生異常。另外,我們還對不同基因型細(xì)胞中ATP濃度進(jìn)行了檢測。發(fā)現(xiàn)與對照組相比,SPG42患者皮膚成纖維細(xì)胞的ATP濃度明顯降低,說明Slc33a1S113R錯(cuò)義突變導(dǎo)致線粒體ATP合成能力受到影響。為了進(jìn)一步探究SLC33A1是如何影響線粒體形態(tài)和功能的,我們首先對SLC33A1的亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究。已有文獻(xiàn)報(bào)道,SLC33A1是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ac-CoA的轉(zhuǎn)運(yùn)體,可參與多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的乙�；揎椷^程進(jìn)而影響其生物學(xué)功能的維持,如APP切割蛋白BACE1、低密度脂蛋白受體LDLR和自噬相關(guān)蛋白ATG9A等。通過免疫熒光共定位分析,我們首次確認(rèn)SLC33A1不僅定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),還部分定位于線粒體上。因此,我們推測SLC33A1參與線粒體相關(guān)蛋白的乙�；揎椷^程,從而影響了其功能的維持。綜上所述,我們確定Slc33a1S113R基因敲入雜合子小鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞中線粒體形態(tài)異常。并且Slc33a1S113R錯(cuò)義突變引起線粒體軸漿運(yùn)輸異常,導(dǎo)致神經(jīng)元軸突中線粒體堆積,造成軸突的腫脹。此外,線粒體膜電位及ATP合成能力受到影響。通過免疫熒光共定位,確定SLC33A1在細(xì)胞內(nèi)與線粒體存在部分共定位情況。以上研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)SLC33A1的功能及探討Slc33a1S113R錯(cuò)義突變導(dǎo)致HSP的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索。
[Abstract]:In order to study the effect of SLC33a1S113R gene on mitochondrial function , it was found that SLC33a1S113R gene could survive early embryo development . In vivo experiments , we found that the mitochondrial membrane potential level in the brain cortex of mice with Slc33a1wt / mut mutation was significantly lower than that of the control group .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R741

【相似文獻(xiàn)】

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1 李昭輝;遺傳性痙攣性截癱致病基因SLC33A1突變位點(diǎn)c.339T＞G（p.Ser113Arg）的確定及功能分析[D];山東大學(xué);2015年

2 馬健;遺傳性痙攣性截癱致病基因SLC33A1錯(cuò)義突變對線粒體影響的初步探討[D];山東大學(xué);2017年

3 趙寶悅;對遺傳性痙攣性截癱致病基因SLC33A1功能及致病機(jī)制的初步探討[D];山東大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：1926116