本文選題：自噬 + 胃癌�。� 參考：《吉林大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景胃癌作為消化道惡性腫瘤中最常見的一類惡性疾病,胃癌的發(fā)生涉及眾多與基因、蛋白等相關的微觀原因。在我國消化道惡性腫瘤的發(fā)病率中連續(xù)數(shù)年高居榜首,每年新發(fā)病例數(shù)目相當巨大,而且我國的胃癌發(fā)生率和死亡率也在世界上位居第三位,城市居民癌癥死亡率中胃癌的死亡率位于第二位,農村居民癌癥死亡率中胃癌的死亡率位于第一位[1,2];胃癌的死亡率在惡性腫瘤死亡率中占首位。我國作為全球范圍內胃癌發(fā)病率最高的國家,由于我國農村居民人口眾多,農村經濟文化水平與城市之間存在巨大的落差,這使得農村人群接受的教育程度、醫(yī)療條件和經濟條件相對較差,導致我國的胃癌具有一些獨特的自身特點:農村地區(qū)人口的胃癌發(fā)病率和死亡率均明顯高于城市人口。而在發(fā)病部位方面,相對于最常見于小彎側和幽門區(qū)域的胃癌而言,發(fā)生于胃食管結合部腺癌(賁門癌)的發(fā)病率正呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢[3-6]。胃癌因其惡性程度高、進展期腫瘤預后較差、嚴重威脅人類的健康。研究發(fā)現(xiàn)關于胃癌發(fā)生的分子機制包括抑癌基因失活,癌基因活化,細胞周期調節(jié)失控,細胞信號轉導通路異常等多種相關因素,但是關于胃癌的發(fā)病具病因和相關體機制仍然存在著諸多疑問和大片的空白,亟待相關研究人員進行不斷而深入的探索。此外,關于胃癌發(fā)生機制的研究對于胃癌的早期診治也具有非常重要的意義[7]。自噬泛指溶酶體(lysosomes)介導的細胞質降解過程,正常情況下,機體的細胞很少會發(fā)生自噬,但是饑餓、氧化應激、損傷、能量代謝缺乏等來自細胞內外的代謝壓力能夠誘導自噬發(fā)生,細胞內外的各種刺激作用于細胞,誘導胞漿中內質網、高爾基體、線粒體來源的杯形具有雙層膜結構的自噬前體的形成,導致自噬水平顯著升高,促進細胞內物質的循環(huán)利用,并且自噬體的膜也會脫落并進行再循環(huán)和重復利用。自噬具有極為重要的生物學意義,它是維持細胞代謝活動平穩(wěn)進行的主要貢獻者之一。當外源性的營養(yǎng)物質、能量缺乏,不足以維持正常代謝時,自噬的有序進行可以為機體提供內源性的營養(yǎng)物質和能量,保證細胞在嚴峻的生存條件下得以存活。而且自噬還在機體細胞的成分更新、組織的代謝、生長及發(fā)育等一些列重要的生命基本進程中起到非常重要的生物學作用[8]。此外,自噬也與人體的許多疾病發(fā)生、發(fā)展關系密切,例如神經退行性疾病,Danon肌病等[9,10]。自噬是所有真核細胞生命和代謝活動中的一個較為普遍生物學現(xiàn)象,因此也參與腫瘤細胞的生命和代謝活動。自噬在癌癥發(fā)生和發(fā)展的進程中發(fā)揮的作用相當復雜,我們不能簡單的認為自噬能夠促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展或抑制癌變的發(fā)生,例如自噬對細胞內線粒體具有一定的隔離作用,這種自發(fā)的隔離作用可在一定程度上防止促凋亡因子的擴散,幫助機體細胞逃避凋亡;抑制機體自噬可使機體的蛋白降解變緩慢,合成代謝增加,從而導致癌前病變細胞持續(xù)生長。目前有許多研究已經證實,自噬在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起到了重要的作用,但是其在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中更為具體的作用機制,以及是否能對實際的臨床工作具有指導意義仍然是未知數(shù)。在哺乳動物中與細胞自噬功能相關的基因里,Beclin-1是第一個在哺乳動物細胞中被發(fā)現(xiàn)的自噬相關基因,其產物既可以介導自噬蛋白定位于自噬前體結構,也是參與機體自噬體形成調控的關鍵基因,與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Beclin-1不僅可以促進真核細胞自噬功能的活化,同時也參與細胞凋亡的調節(jié)。究證實Beclin-1除了能夠發(fā)揮調節(jié)自噬水平的作用之外也是一種明確的抑癌因子。Beclin-1等位基因的缺失和突變與肝癌、肺癌、淋巴瘤及乳腺癌等世界范圍內較為常見的且致死率較高的惡性疾病的發(fā)生發(fā)展過程密切相關[11-14]。但是這些疾病發(fā)生的內在的機制是否與自噬這一過程直接相關仍有待進一步深入的探討。目前已有的對Beclin-1基因在自噬過程中調控作用的研究表明,這一基因的產物可以通過與Ⅲ型PI3K(phosphatidylinositol 3,kinase)等自噬過程中的關鍵位點結構結合形成一個全新的復合物結構,進而完成對于其他的ATG蛋白激活或抑制的微觀調控,影響ATG蛋白在自噬前體結構中的相對空間位置,最終完成該基因對自噬的有效調控作用。而另外一種對于自噬具有重要意義的分子結構即為微管相關蛋白輕鏈3(micro-tubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)。LC3是一種在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)的,與酵母中的自噬相關基因Atg8是同一來源的類似物。LC3-Ⅱ是LC3的存在形式之一,與LC3的另一種存在形式LC3-Ⅰ的分布部位不盡相同,LC3-Ⅱ主要存在于自噬體的雙層膜結構之上,是一種對于自噬研究非常重要的標記物,可以通過對于LC3-Ⅱ的檢測和觀察,從而判斷是否發(fā)生自噬和評估自噬的水平。目的本文將從多方面闡述自噬基因Beclin-1與不同時期胃癌組織之間的關聯(lián),并深入探究Beclin-1在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制,以及對IFN-γ對胃癌細胞的作用和作用機制進行探究,為臨床上治療胃癌尋找靶點提供理論依據(jù)。方法(1)選取2013年6月至2014年9月間于吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院普通外科行胃癌根治術后所得的胃癌組織標本共75例,其中16例屬于胃癌Ⅰ期,40例屬于胃癌Ⅱ期,19例屬于胃癌Ⅲ期,然后使用免疫組織化學、RT-PCR技術和Western Blot進行檢測,分別檢測Beclin-1和IFN-γ在胃癌組織標本中的m RNA表達與蛋白的水平。應用流式細胞儀檢測技術分析分泌IFN-γ的免疫細胞百分比。(2)Western Blot檢測Beclin-1在BGC-823和MKN-28兩個細胞株及正常胃粘膜上皮細胞株GES-1中的表達水平。半定量RT-PCR檢測成其中中Beclin-1的m RNA表達;CCK-8檢測IFN-γ對BGC-823細胞株增殖的影響,Western Blot和半定量RT-PCR檢測IFN-γ分別作用于BGC-823細胞后,檢測自噬標志物LC3、Beclin-1的m RNA表達與蛋白的水平。分析Beclin-1在不同胃癌中的表達水平對細胞凋亡調控機制,為此檢測凋亡相關蛋白Bcl-2,Casepase3的m RNA表達與蛋白的水平。(3)取雌性BALB/c裸鼠,在無特定病原體條件下進行飼養(yǎng),自由飲食。構建嚙齒動物異種移植瘤模型,將生長到指數(shù)生長期的胃癌細胞(BGC-823)皮下接種到小鼠背部。14天后處死小鼠,得到腫瘤后將其研磨后接種于新的裸鼠的右側腋窩下,最終得到異種移植瘤模型。將小鼠隨機分為空白對照組和IFN-γ干預組,連續(xù)每天測量和記錄腫瘤的直徑和小鼠的存活狀態(tài)。Western blot檢測小鼠體內腫瘤組織細胞的LC3和Beclin-1的蛋白水平。結果1.癌癥早期(TNM分期為Ⅰ和Ⅱ期),胃癌組織中的自噬相關基因Beclin-1也有較高水平表達。Beclin-1高水平表達這種類似的變化并沒有在癌癥晚期(TNM分期為Ⅲ期)的癌組織中觀察到。癌旁細胞的Beclin-1表達維持在一個穩(wěn)定水平,組織樣本中分泌IFN-γ的免疫細胞在癌癥分化程度較好的細胞中高表達。以上結果表明胃癌組織內的Beclin-1、IFN-γ的表達水平可能與癌癥分期呈負相關。2.Beclin-1在MNK-28中表達最高,正常胃癌細胞GES-1內大于BGC-823中的表達,且各組間差異顯著(P0.05),INF-γ治療后BGC-823細胞株的LC3的表達和Beclin-1的表達都顯著增加,細胞增殖能力下降,凋亡相關蛋白表達水平也隨之發(fā)生改變。3.INF-γ治療后腫瘤組織的LC3的表達和Beclin-1的表達都顯著增加,INF-γ組異種移植腫瘤組織的體積明顯小于對照組;INF-γ處理4周后與對照組相比裸鼠體重和存活率都出現(xiàn)明顯升高。結論1.自噬與胃癌的病理分期有密切關系,在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。Beclin-1,INF-γ與胃癌的病理特征之間有密切關系。Beclin-1在Ⅰ期和Ⅱ期胃癌組織標本中有較高水平表達,而在Ⅲ期胃癌組織標本中表達較前兩期低。2.INF-γ與胃癌的發(fā)生發(fā)展也關系密切,在IFN-γ刺激后的胃癌細胞和組織中的自噬相關基因Beclin-1和LC3表達量增加。3.自噬相關基因Beclin-1與胃癌的分化程度和浸潤深度有著密切聯(lián)系,與是否發(fā)生淋巴結轉移無明顯關聯(lián)。4.INF-γ誘導激活自噬后可以抑制腫瘤細胞增殖,促進凋亡而抑制腫瘤的生長,能夠明顯的縮小腫瘤體積、延長荷瘤小鼠的存活期。
[Abstract]:Gastric cancer is the most common type of gastric cancer in the world . The incidence and mortality of gastric cancer in our country are significantly higher than those in the urban population . Autophagocytosis is a process of cytoplasmic degradation mediated by lysosomes . In normal conditions , the cells of the organism can induce autophagy , but starvation , oxidative stress , damage , and lack of energy metabolism can induce autophagy . Beclin - 1 plays an important role in the pathogenesis and development of gastric cancer . Beclin - 1 plays an important role in the pathogenesis and development of gastric cancer . LC3 - 鈪，

本文編號：1921969