本文選題：自噬 + 胃癌　； 參考：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景胃癌作為消化道惡性腫瘤中最常見的一類惡性疾病,胃癌的發(fā)生涉及眾多與基因、蛋白等相關(guān)的微觀原因。在我國消化道惡性腫瘤的發(fā)病率中連續(xù)數(shù)年高居榜首,每年新發(fā)病例數(shù)目相當(dāng)巨大,而且我國的胃癌發(fā)生率和死亡率也在世界上位居第三位,城市居民癌癥死亡率中胃癌的死亡率位于第二位,農(nóng)村居民癌癥死亡率中胃癌的死亡率位于第一位[1,2];胃癌的死亡率在惡性腫瘤死亡率中占首位。我國作為全球范圍內(nèi)胃癌發(fā)病率最高的國家,由于我國農(nóng)村居民人口眾多,農(nóng)村經(jīng)濟(jì)文化水平與城市之間存在巨大的落差,這使得農(nóng)村人群接受的教育程度、醫(yī)療條件和經(jīng)濟(jì)條件相對(duì)較差,導(dǎo)致我國的胃癌具有一些獨(dú)特的自身特點(diǎn):農(nóng)村地區(qū)人口的胃癌發(fā)病率和死亡率均明顯高于城市人口。而在發(fā)病部位方面,相對(duì)于最常見于小彎側(cè)和幽門區(qū)域的胃癌而言,發(fā)生于胃食管結(jié)合部腺癌(賁門癌)的發(fā)病率正呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢[3-6]。胃癌因其惡性程度高、進(jìn)展期腫瘤預(yù)后較差、嚴(yán)重威脅人類的健康。研究發(fā)現(xiàn)關(guān)于胃癌發(fā)生的分子機(jī)制包括抑癌基因失活,癌基因活化,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常等多種相關(guān)因素,但是關(guān)于胃癌的發(fā)病具病因和相關(guān)體機(jī)制仍然存在著諸多疑問和大片的空白,亟待相關(guān)研究人員進(jìn)行不斷而深入的探索。此外,關(guān)于胃癌發(fā)生機(jī)制的研究對(duì)于胃癌的早期診治也具有非常重要的意義[7]。自噬泛指溶酶體(lysosomes)介導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)降解過程,正常情況下,機(jī)體的細(xì)胞很少會(huì)發(fā)生自噬,但是饑餓、氧化應(yīng)激、損傷、能量代謝缺乏等來自細(xì)胞內(nèi)外的代謝壓力能夠誘導(dǎo)自噬發(fā)生,細(xì)胞內(nèi)外的各種刺激作用于細(xì)胞,誘導(dǎo)胞漿中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體來源的杯形具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬前體的形成,導(dǎo)致自噬水平顯著升高,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的循環(huán)利用,并且自噬體的膜也會(huì)脫落并進(jìn)行再循環(huán)和重復(fù)利用。自噬具有極為重要的生物學(xué)意義,它是維持細(xì)胞代謝活動(dòng)平穩(wěn)進(jìn)行的主要貢獻(xiàn)者之一。當(dāng)外源性的營養(yǎng)物質(zhì)、能量缺乏,不足以維持正常代謝時(shí),自噬的有序進(jìn)行可以為機(jī)體提供內(nèi)源性的營養(yǎng)物質(zhì)和能量,保證細(xì)胞在嚴(yán)峻的生存條件下得以存活。而且自噬還在機(jī)體細(xì)胞的成分更新、組織的代謝、生長及發(fā)育等一些列重要的生命基本進(jìn)程中起到非常重要的生物學(xué)作用[8]。此外,自噬也與人體的許多疾病發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,例如神經(jīng)退行性疾病,Danon肌病等[9,10]。自噬是所有真核細(xì)胞生命和代謝活動(dòng)中的一個(gè)較為普遍生物學(xué)現(xiàn)象,因此也參與腫瘤細(xì)胞的生命和代謝活動(dòng)。自噬在癌癥發(fā)生和發(fā)展的進(jìn)程中發(fā)揮的作用相當(dāng)復(fù)雜,我們不能簡單的認(rèn)為自噬能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展或抑制癌變的發(fā)生,例如自噬對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體具有一定的隔離作用,這種自發(fā)的隔離作用可在一定程度上防止促凋亡因子的擴(kuò)散,幫助機(jī)體細(xì)胞逃避凋亡;抑制機(jī)體自噬可使機(jī)體的蛋白降解變緩慢,合成代謝增加,從而導(dǎo)致癌前病變細(xì)胞持續(xù)生長。目前有許多研究已經(jīng)證實(shí),自噬在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起到了重要的作用,但是其在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中更為具體的作用機(jī)制,以及是否能對(duì)實(shí)際的臨床工作具有指導(dǎo)意義仍然是未知數(shù)。在哺乳動(dòng)物中與細(xì)胞自噬功能相關(guān)的基因里,Beclin-1是第一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的自噬相關(guān)基因,其產(chǎn)物既可以介導(dǎo)自噬蛋白定位于自噬前體結(jié)構(gòu),也是參與機(jī)體自噬體形成調(diào)控的關(guān)鍵基因,與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Beclin-1不僅可以促進(jìn)真核細(xì)胞自噬功能的活化,同時(shí)也參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。究證實(shí)Beclin-1除了能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)自噬水平的作用之外也是一種明確的抑癌因子。Beclin-1等位基因的缺失和突變與肝癌、肺癌、淋巴瘤及乳腺癌等世界范圍內(nèi)較為常見的且致死率較高的惡性疾病的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)[11-14]。但是這些疾病發(fā)生的內(nèi)在的機(jī)制是否與自噬這一過程直接相關(guān)仍有待進(jìn)一步深入的探討。目前已有的對(duì)Beclin-1基因在自噬過程中調(diào)控作用的研究表明,這一基因的產(chǎn)物可以通過與Ⅲ型PI3K(phosphatidylinositol 3,kinase)等自噬過程中的關(guān)鍵位點(diǎn)結(jié)構(gòu)結(jié)合形成一個(gè)全新的復(fù)合物結(jié)構(gòu),進(jìn)而完成對(duì)于其他的ATG蛋白激活或抑制的微觀調(diào)控,影響ATG蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的相對(duì)空間位置,最終完成該基因?qū)ψ允傻挠行д{(diào)控作用。而另外一種對(duì)于自噬具有重要意義的分子結(jié)構(gòu)即為微管相關(guān)蛋白輕鏈3(micro-tubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)。LC3是一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的,與酵母中的自噬相關(guān)基因Atg8是同一來源的類似物。LC3-Ⅱ是LC3的存在形式之一,與LC3的另一種存在形式LC3-Ⅰ的分布部位不盡相同,LC3-Ⅱ主要存在于自噬體的雙層膜結(jié)構(gòu)之上,是一種對(duì)于自噬研究非常重要的標(biāo)記物,可以通過對(duì)于LC3-Ⅱ的檢測和觀察,從而判斷是否發(fā)生自噬和評(píng)估自噬的水平。目的本文將從多方面闡述自噬基因Beclin-1與不同時(shí)期胃癌組織之間的關(guān)聯(lián),并深入探究Beclin-1在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制,以及對(duì)IFN-γ對(duì)胃癌細(xì)胞的作用和作用機(jī)制進(jìn)行探究,為臨床上治療胃癌尋找靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。方法(1)選取2013年6月至2014年9月間于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院普通外科行胃癌根治術(shù)后所得的胃癌組織標(biāo)本共75例,其中16例屬于胃癌Ⅰ期,40例屬于胃癌Ⅱ期,19例屬于胃癌Ⅲ期,然后使用免疫組織化學(xué)、RT-PCR技術(shù)和Western Blot進(jìn)行檢測,分別檢測Beclin-1和IFN-γ在胃癌組織標(biāo)本中的m RNA表達(dá)與蛋白的水平。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)分析分泌IFN-γ的免疫細(xì)胞百分比。(2)Western Blot檢測Beclin-1在BGC-823和MKN-28兩個(gè)細(xì)胞株及正常胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1中的表達(dá)水平。半定量RT-PCR檢測成其中中Beclin-1的m RNA表達(dá);CCK-8檢測IFN-γ對(duì)BGC-823細(xì)胞株增殖的影響,Western Blot和半定量RT-PCR檢測IFN-γ分別作用于BGC-823細(xì)胞后,檢測自噬標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin-1的m RNA表達(dá)與蛋白的水平。分析Beclin-1在不同胃癌中的表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制,為此檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2,Casepase3的m RNA表達(dá)與蛋白的水平。(3)取雌性BALB/c裸鼠,在無特定病原體條件下進(jìn)行飼養(yǎng),自由飲食。構(gòu)建嚙齒動(dòng)物異種移植瘤模型,將生長到指數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞(BGC-823)皮下接種到小鼠背部。14天后處死小鼠,得到腫瘤后將其研磨后接種于新的裸鼠的右側(cè)腋窩下,最終得到異種移植瘤模型。將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和IFN-γ干預(yù)組,連續(xù)每天測量和記錄腫瘤的直徑和小鼠的存活狀態(tài)。Western blot檢測小鼠體內(nèi)腫瘤組織細(xì)胞的LC3和Beclin-1的蛋白水平。結(jié)果1.癌癥早期(TNM分期為Ⅰ和Ⅱ期),胃癌組織中的自噬相關(guān)基因Beclin-1也有較高水平表達(dá)。Beclin-1高水平表達(dá)這種類似的變化并沒有在癌癥晚期(TNM分期為Ⅲ期)的癌組織中觀察到。癌旁細(xì)胞的Beclin-1表達(dá)維持在一個(gè)穩(wěn)定水平,組織樣本中分泌IFN-γ的免疫細(xì)胞在癌癥分化程度較好的細(xì)胞中高表達(dá)。以上結(jié)果表明胃癌組織內(nèi)的Beclin-1、IFN-γ的表達(dá)水平可能與癌癥分期呈負(fù)相關(guān)。2.Beclin-1在MNK-28中表達(dá)最高,正常胃癌細(xì)胞GES-1內(nèi)大于BGC-823中的表達(dá),且各組間差異顯著(P0.05),INF-γ治療后BGC-823細(xì)胞株的LC3的表達(dá)和Beclin-1的表達(dá)都顯著增加,細(xì)胞增殖能力下降,凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平也隨之發(fā)生改變。3.INF-γ治療后腫瘤組織的LC3的表達(dá)和Beclin-1的表達(dá)都顯著增加,INF-γ組異種移植腫瘤組織的體積明顯小于對(duì)照組;INF-γ處理4周后與對(duì)照組相比裸鼠體重和存活率都出現(xiàn)明顯升高。結(jié)論1.自噬與胃癌的病理分期有密切關(guān)系,在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。Beclin-1,INF-γ與胃癌的病理特征之間有密切關(guān)系。Beclin-1在Ⅰ期和Ⅱ期胃癌組織標(biāo)本中有較高水平表達(dá),而在Ⅲ期胃癌組織標(biāo)本中表達(dá)較前兩期低。2.INF-γ與胃癌的發(fā)生發(fā)展也關(guān)系密切,在IFN-γ刺激后的胃癌細(xì)胞和組織中的自噬相關(guān)基因Beclin-1和LC3表達(dá)量增加。3.自噬相關(guān)基因Beclin-1與胃癌的分化程度和浸潤深度有著密切聯(lián)系,與是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)聯(lián)。4.INF-γ誘導(dǎo)激活自噬后可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡而抑制腫瘤的生長,能夠明顯的縮小腫瘤體積、延長荷瘤小鼠的存活期。
[Abstract]:Gastric cancer is the most common type of gastric cancer in the world . The incidence and mortality of gastric cancer in our country are significantly higher than those in the urban population . Autophagocytosis is a process of cytoplasmic degradation mediated by lysosomes . In normal conditions , the cells of the organism can induce autophagy , but starvation , oxidative stress , damage , and lack of energy metabolism can induce autophagy . Beclin - 1 plays an important role in the pathogenesis and development of gastric cancer . Beclin - 1 plays an important role in the pathogenesis and development of gastric cancer . LC3 - 鈪，

本文編號(hào)：1921969