本文選題：菰黑粉菌 + 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化　； 參考：《中國(guó)計(jì)量大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：菰黑粉菌(Ustilago esculenta)可以侵染茭白植株并刺激其基部膨大形成可食用茭白。研究發(fā)現(xiàn),菰黑粉菌存在菌絲型、酵母型兩種型態(tài)；而在玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)中,酵母型沒(méi)有致病性,而菌絲型具有致病性并侵染玉米植株；目前認(rèn)為菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換與茭白的形成密切相關(guān),而遺傳交配“位點(diǎn)在多種黑粉菌屬真菌中被證實(shí)調(diào)控真菌的二型態(tài)的轉(zhuǎn)換,且主要由“位點(diǎn)上mfa、pra基因協(xié)同作用。菰黑粉菌的基因組測(cè)序結(jié)果顯示其存在mfas pra的同源基因,但是其a位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)以及在調(diào)節(jié)菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程中的分子機(jī)制尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究以分離得到的菰黑粉菌性親和單倍體(UeT14、UeT55、UeMT10、UeMT46)為實(shí)驗(yàn)材料,從分子生物學(xué)角度研究菰黑粉菌中a位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)及其功能,明確a位點(diǎn)上的mfa、pra基因?qū)院诜劬婢蛻B(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)作用。首先以UeT55單倍體菌株為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)對(duì)酶解條件、穩(wěn)滲劑、再生培養(yǎng)基、載體、抗性篩選標(biāo)記的優(yōu)化篩選,建立并優(yōu)化了PEG介導(dǎo)的菰黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系,為菰黑粉菌基因功能研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。結(jié)果表明：菰黑粉菌在15 mg/mL Lywallzyme酶解液中,以山梨醇或蔗糖為穩(wěn)滲劑于30℃下酶解3 h,原生質(zhì)體產(chǎn)率達(dá)到最大值,在以山梨醇或蔗糖為穩(wěn)滲劑的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)可得到較高的轉(zhuǎn)化效率；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)線性化的外源DNA才能導(dǎo)入菰黑粉菌,且最佳的抗性篩選標(biāo)記為潮霉素和萎銹靈。同時(shí)根據(jù)菰黑粉菌全基因組序列信息和已報(bào)道的a基因結(jié)構(gòu)特征,設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行長(zhǎng)片段克隆,分別對(duì)UeMT10、UeMT46、UeT14、UeT55四個(gè)菌株的“位點(diǎn)進(jìn)行了克隆及生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明：菰黑粉菌存在3個(gè)a等位基因a,、a2、a3,且每個(gè)a位點(diǎn)上存在兩個(gè)信息素基因(mmfa),一個(gè)信息素受體基因(pra),其中UeT14菌株中為a1,包含mfal.2、 mfa1.3、pral; UeT55、UeMT46菌株中為a2,包含mfa2.1、mfa2.3、pra2；UeMT10菌株中為a3,包含mfa3.1、mfa3.2、pra3;而且菰黑粉菌a位點(diǎn)基因與玉米瘤黑粉菌、玉米絲黑穗病黑粉菌(Sporisorium reilianum)等具有較高的同源性,說(shuō)明a基因可能在菰黑粉菌中也負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)真菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換信號(hào)。因此我們以UeT55為實(shí)驗(yàn)材料,進(jìn)一步通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法分別敲除菌株中的mmfa或pra基因,研究mmfa或pra基因?qū)院诜劬蛻B(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)控機(jī)制。試驗(yàn)采用UeT14-Δmaf1.2、UeT14-Δmfa1.3、UeT14-Δpra1、UeT55-Δmfa2.1、UeT55-Δmfa2.3、UeT55-Δ pra2基因缺失菌株進(jìn)行體外融合試驗(yàn),結(jié)果表明：當(dāng)mfa1.2-pra2、mfa2.1-pra1兩對(duì)信息素-信息素受體基因同時(shí)存在時(shí)(野生菌株或mfa1.3/mfa2.3基因缺失菌株體外融合培養(yǎng)),菰黑粉菌性親和菌株UeT14和UeT55可以生長(zhǎng)芽管并通過(guò)芽管進(jìn)行細(xì)胞融合繼而生長(zhǎng)菌絲；當(dāng)只有一對(duì)信息素-信息素受體基因mfa1.2-pra2或mfa2.1-pra1存在時(shí),菰黑粉菌菌株UeT14和UeT55混合培養(yǎng)下可以生長(zhǎng)芽管,但是無(wú)法進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞融合和菌絲生長(zhǎng)；當(dāng)mfa1.2-pra2和mfa2.1-pra1兩對(duì)信息素-信息素受體基因中各缺失一個(gè)以上基因時(shí),菰黑粉菌菌株UeT14和UeT55既不生長(zhǎng)芽管,也無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞融合和菌絲生長(zhǎng)。同時(shí)我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),比較分析上述進(jìn)行體外融合試驗(yàn)的菰黑粉菌菌株中未缺失的a基因表達(dá)模式以及a基因下游途徑基因(Uegpa3、Ueubc2)的動(dòng)態(tài)表達(dá),研究a基因在菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換中的信號(hào)調(diào)控機(jī)制。試驗(yàn)首先根據(jù)菰黑粉菌全基因組信息克隆了Uegpa3、Ueubc2基因并通過(guò)體外融合試驗(yàn)確認(rèn)它們調(diào)控菰黑粉菌菌絲融合生長(zhǎng)過(guò)程。進(jìn)一步的qRT-PCR結(jié)果顯示：在體外融合過(guò)程中,與野生型菌株相比,當(dāng)mfa1.2-pra2和mfa2.1-pra1兩對(duì)組合中任何基因缺失時(shí),其它mfa、pra基因的表達(dá)受到不同程度的影響；當(dāng)mfa1.3、mfa2.3缺失后對(duì)其它mfa、pra基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯的變化,表明mfa1.2-pra2、mfa2.1-pra1基因共同參與調(diào)節(jié)菰黑粉菌的細(xì)胞融合及菌絲形成的信號(hào)途徑。同時(shí)對(duì)融合組合中Uegpa3、 Ueubc2基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有菌絲或芽管生長(zhǎng)的融合組合中,其Uegpa3、Ueubc2基因表達(dá)分別在芽管生長(zhǎng)初期和菌絲生長(zhǎng)后期表達(dá)量相對(duì)較高,且趨勢(shì)基本一致；而在菌落為酵母型且無(wú)芽管生長(zhǎng)的組合中,Uegpa3、Ueubc2基因表達(dá)變化未能呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性。說(shuō)明Ueubc2、 Uegpa3基因參與mfa、pra基因調(diào)節(jié)的菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換,但是兩者之間的關(guān)系需要更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。
[Abstract]:Ustilago esculenta could infect Zizania caduciflora and stimulate its base to expand to form edible Zizania latifolia .
However , in Ustilago maydis , there was no pathogenicity in the yeast type , while the mycelium was pathogenic and infected with maize plants .
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本文編號(hào)：1918892