發(fā)布時間：2018-05-21 06:53

  本文選題：銜接蛋白 + 果膠酶��； 參考：《中國農(nóng)業(yè)科學》2017年08期

【摘要】：【目的】明確銜接蛋白(adaptor protein)GcAP1復(fù)合體β亞基在蘋果炭疽葉枯病菌(Glomerella cingulata)生長發(fā)育和致病過程中的功能,檢測GcAP1β在該菌中的時空表達模式,并揭示其是否調(diào)控多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶(endopolygalacturonase)基因CgPG1和CgPG2、果膠裂解酶(pectin lyase)基因pnl-1和pnl-2以及果膠酸酯裂解酶(pectate lyase)基因pelA和pelB的表達,為深入開展蘋果炭疽葉枯病菌銜接蛋白在致病信號傳導途徑中的分子機制研究打下基礎(chǔ)�！痉椒ā客ㄟ^構(gòu)建GcAP1β基因敲除載體和GcAP1β-gfp融合表達載體,利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)(ATMT)獲得Δgcap1β突變體和GcAP1β恢復(fù)菌株Δgcap1β-GcAP1β,并由RT-PCR和Southern雜交分析進行鑒定。以野生型菌株W16為對照,對Δgcap1β突變體和GcAP1β恢復(fù)菌株Δgcap1β-GcAP1β的生長速度、產(chǎn)孢能力、分生孢子萌發(fā)率及附著胞形成率和致病性進行測定。利用生物信息學軟件Prot Comp 9.0和TMHMM對GcAP1β蛋白進行結(jié)構(gòu)分析,并結(jié)合GcAP1β-GFP信號觀測,進行GcAP1β的亞細胞定位。利用qRT-PCR技術(shù),檢測GcAP1β在菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵染階段的表達量,并檢測CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB在野生型菌株和Δgcap1β突變體中的表達量�！窘Y(jié)果】GcAP1β基因全長2 321bp,含有3個內(nèi)含子,編碼720個氨基酸。與野生型菌株W16相比,Δgcap1β突變體菌落成褶皺狀,菌絲生長速度明顯減慢,而分生孢子產(chǎn)量、分生孢子萌發(fā)率、附著胞形成率無顯著差異。Δgcap1β致病力明顯降低,僅在蘋果葉片上引起極小的點狀斑。GcAP1β基因恢復(fù)菌株Δgcap1β-GcAP1β完全修復(fù)了因GcAP1β基因缺失造成的表型缺陷。熒光檢測顯示,融合蛋白GcAP1β-GFP分布于細胞質(zhì)中。qRT-PCR檢測結(jié)果表明,GcAP1β在蘋果炭疽葉枯病菌各個發(fā)育階段都有表達,且在侵染后表達量相對最高。GcAP1β的缺失導致CgPG1表達量降低至20.3%,CgPG2表達量降低至16.5%,pnl-1表達量降低至8.2%,pnl-2表達量降低至14.4%,pelA表達量降低至4.4%,pelB表達量降至0.8%。【結(jié)論】銜接蛋白GcAP1復(fù)合體分布于細胞質(zhì)中,是蘋果炭疽葉枯病菌生長發(fā)育所需要的;GcAP1調(diào)控CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB的表達,是蘋果炭疽葉枯病菌一個重要的毒力因子。
[Abstract]:[objective] to investigate the function of 尾 subunit of adaptor protein)GcAP1 complex in the growth, development and pathogenicity of Glomerella cingulata, and to detect the temporal and spatial expression pattern of GcAP1 尾 in this bacterium. The expression of CgPG1 and CgPG2, pnl-1 and pnl-2 of pectin lyase, and pelA and pelB of pectate lyase were investigated. To lay a foundation for the further study of the molecular mechanism of the binding protein of anthracis in the pathogenicity signal transduction pathway. [methods] the GcAP1 尾 gene knockout vector and the GcAP1 尾 -gfp fusion expression vector were constructed. The 螖 gcap1 尾 mutants and GcAP1 尾 restoring strain 螖 gcap1 尾 -GcAP1 尾 were obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation and identified by RT-PCR and Southern hybridization. The growth rate, sporulation ability, conidia germination rate, attachment formation rate and pathogenicity of 螖 gcap1 尾 mutant and GcAP1 尾 restoring strain 螖 gcap1 尾 -GcAP1 尾 were determined by using wild-type strain W16 as control. The structure of GcAP1 尾 protein was analyzed by bioinformatics software Prot Comp 9.0 and TMHMM, and the subcellular localization of GcAP1 尾 was carried out with the observation of GcAP1 尾 -GFP signal. QRT-PCR technique was used to detect the expression of GcAP1 尾 in hyphae, conidia, bud tube, appressorium and infection stage, and to detect the expression of CgPG1CgPG2pnl-1pnl-2pnl-2pnl-2pelA and pelB in wild type strains and 螖 gcap1 尾 mutants. [results] the whole length of GcAP1 尾 gene was 2 321bpp, containing three introns. Encoding 720 amino acids. Compared with wild-type strain W16, 螖 gcap1 尾 mutant colony became fold shape, hyphal growth rate slowed obviously, but conidial yield, conidia germination rate and appressant formation rate were not significantly different. 螖 gcap1 尾 pathogenicity was significantly decreased. The phenotypic defect caused by the deletion of GcAP1 尾 gene was completely repaired by 螖 gcap1 尾 -GcAP1 尾 gene restoring strain 螖 gcap1 尾 in apple leaves. Fluorescence detection showed that the fusion protein GcAP1 尾 -GFP was distributed in the cytoplasm. QRT-PCR results showed that GcAP1 尾 was expressed in all developmental stages of anthracis. After infection, the relative highest expression of .GcAP1 尾 resulted in the decrease of CgPG1 expression to 20.3kg. the expression of CgPG2 decreased to 16.5pnl-1. The expression of pnl-1 decreased to 8.2pnl-2, and the expression of pnl-2 decreased to 14.4pelA to 4.4pelB. [conclusion] the expression of the cohesion protein GcAP1 is reduced to 0.80.The expression of pnl-1 is reduced to 8.2pnl-2. [conclusion] the expression of the cohesion protein GcAP1 is reduced to 0.84pelB. [conclusion] The zygote is distributed in the cytoplasm, GcAP1 is an important virulence factor for the growth and development of anthrax leaf blight in apple, which regulates the expression of CgPG1, CgPG1, pnl-1, pnl-2pnl-2pnl-2pnl-2, and is an important virulence factor of anthrax leaf blight in apple.
【作者單位】： 中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所;
【基金】：國家自然科學基金青年科學基金(31501596) 中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(1610182016002) 中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程
【分類號】：S436.611.12

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本文編號：1918190