本文選題：牦牛 + TMEM18��； 參考：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：我國是世界牦牛擁有量最多的國家,但牦牛的生長周期長,繁殖性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他牛種,這限制了牦牛畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的進(jìn)一步發(fā)展�？缒さ鞍�18(TMEM18)是一個末端為低聚嘧啶的基因,該基因與動物生長發(fā)育和繁殖性能密切相關(guān)。鑒于此,本研究對有關(guān)牦牛TMEM18基因多態(tài)性及其功能的進(jìn)行研究。通過熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法分別檢測了TMEM18在牦牛不同組織中mRNA和蛋白的表達(dá)情況,并利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)對牦牛不同組織中TMEM18蛋白定位;以192頭牦牛血樣DNA構(gòu)建混合池,擴(kuò)增TMEM18基因內(nèi)含子1和外顯子5的序列。運(yùn)用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(high resolution melting curve,HRM)統(tǒng)計基因型分型以及運(yùn)用SPSS 21.0分析基因多態(tài)位點(diǎn)與生產(chǎn)性能關(guān)聯(lián);在質(zhì)粒pIRES2-EGFP的多克隆位點(diǎn)插入TMEM18基因構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-TMEM18,用脂質(zhì)體技術(shù)轉(zhuǎn)染牦牛胎兒成纖維細(xì)胞。利用蛋白免疫印跡法、熒光定量PCR技術(shù)檢測牦牛胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后TMEM18基因的表達(dá)量。研究結(jié)果如下:(1)TMEM18蛋白在牦牛各組織器官中均有表達(dá),其中睪丸中mRNA和蛋白表達(dá)量極顯著高于其他組織(P0.01);在牦牛心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾臟紅髓、脾小梁、肺終末細(xì)支氣管、肺腺體、肺平滑肌、腎臟皮質(zhì)腎小管、骨骼肌細(xì)胞及卵巢顆粒細(xì)胞中呈TMEM18陽性免疫反應(yīng);而在睪丸中精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞和次級精母細(xì)胞中TMEM18陽性反應(yīng)明顯高于其他組織(P0.01)。(2)牦牛TMEM18基因內(nèi)含子1處存在2個多態(tài)位點(diǎn),分別是:861(A/G)和1267(C/T),外顯子5處存在1個多態(tài)位點(diǎn)為4447(C/T)。關(guān)聯(lián)分析表明,牦牛TMEM18基因861(A/G)位點(diǎn)的不同基因型與牦牛的體高、體重、胴體重和屠宰率差異性顯著(P0.05);1267(C/T)位點(diǎn)的不同基因型與牦牛的體高、體重和屠宰率差異性顯著(P0.05),而牦牛TMEM18基因4447(C/T)位點(diǎn)的不同基因型與牦牛的體斜長、管圍、胸圍、體重、胴體重、凈肉重、凈肉率和屠宰率均存在顯著性差異(P0.05)。(3)成功構(gòu)建出pIRES2-EGFP-TMEM18真核表達(dá)載體,驗證發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞TMEM18蛋白和mRNA的表達(dá)量顯著提高(P0.01)。本研究初步篩選出TMEM18與牦牛生產(chǎn)性狀相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)并成功構(gòu)建的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-TMEM18,為今后牦牛遺傳改良和克隆技術(shù)以及基因的功能研究提供基礎(chǔ)。
[Abstract]:China is the country with the largest number of yaks in the world, but the growth cycle of yaks is long, the reproductive performance is far lower than other cattle breeds, which limits the further development of yak animal husbandry economy. Transmembrane protein 18 (TMEM18) is a terminal oligopyrimidine gene, which is closely related to animal growth, development and reproductive performance. In view of this, we studied the polymorphism and function of yak TMEM18 gene. The expression of TMEM18 in different yak tissues was detected by fluorescence quantitative PCR and Western blotting, and the localization of TMEM18 protein in different yak tissues was detected by immunohistochemical staining. The mixed pool was constructed with DNA from 192 yak blood samples and the sequences of intron 1 and exon 5 of TMEM18 gene were amplified. High-resolution fusion curve analysis technique was used to analyze genotype typing of high resolution melting and SPSS 21.0 was used to analyze the relationship between gene polymorphism and production performance. The eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-TMEM18 was constructed by inserting TMEM18 gene into the polyclonal site of plasmid pIRES2-EGFP and transfected into yak fetal fibroblasts by liposome technique. The expression of TMEM18 gene in yak fetal fibroblasts before and after transfection was detected by Western blot and fluorescence quantitative PCR. The results showed that TMEM18 protein was expressed in all tissues and organs of yak, and the expression of mRNA and protein in testis was significantly higher than that in other tissues (P0.01A), and in yak cardiomyocytes, hepatocytes, red pulp of spleen, trabeculae of spleen and bronchioles of lung. TMEM18 positive immunoreactivity was found in lung glands, pulmonary smooth muscle, renal cortex, renal tubules, skeletal muscle cells and ovarian granulosa cells, while spermatogonium cells were found in testis. The positive reaction of TMEM18 in primary spermatocytes and secondary spermatocytes was significantly higher than that in other tissues (P0.01. 01. 2) there were two polymorphic loci in intron 1 of TMEM18 gene of yak, which were: 1: 861 A / G) and 1267 C / T, and 1 polymorphic locus was 4447 C / T at exon 5. The association analysis showed that the different genotypes of the 861 TMEM18 gene and the body height, body weight, carcass weight and slaughter rate of yak were significantly different between the different genotypes of P0.05 and 1267 C / T loci and the body height of yaks. The difference between body weight and slaughter rate was significant (P0.05A), while different genotypes of TMEM18 gene 4447C / T were associated with yak body length, tube circumference, chest circumference, body weight, carcass weight and net meat weight. The eukaryotic expression vector of pIRES2-EGFP-TMEM18 was successfully constructed. The results showed that the expression of TMEM18 protein and mRNA in fibroblasts was increased significantly. The eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-TMEM18 was successfully constructed by screening the polymorphic loci of TMEM18 associated with yak production traits, which provided the basis for the genetic improvement and cloning of Yak and the functional study of the gene.
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;S823.85

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本文編號：1917814