本文選題：干細(xì)胞 + RNA干擾��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的 本研究擬探討FGD6(faciogenital dysplasia)基因?qū)Ω胃杉?xì)胞分化的調(diào)控作用。方法 1.選取FGD6基因的RNA干擾靶序列,將目的片段克隆到穿梭載體p SES-HUS上,再與骨架質(zhì)粒p Adeasy-1共轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中,然后接種到卡那霉素平板中,挑選出陽(yáng)性克隆。將構(gòu)建的質(zhì)粒測(cè)序。2.將測(cè)序證實(shí)正確的質(zhì)粒使用Ad Easy系統(tǒng)構(gòu)建腺病毒載體,包裝并擴(kuò)增重組腺病毒載體p SES-FGD6-si RNA。3.使用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)FGD6蛋白在肝干細(xì)胞HP14.5細(xì)胞中的表達(dá)水平及表達(dá)定位。4.用腺病毒載體p SES-FGD6-si RNA感染HP14.5細(xì)胞,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FGD6、甲胎蛋白(AFP)及白蛋白(Alb)的mRNA水平,Western blot檢測(cè)FGD6、AFP及Alb的蛋白表達(dá)水平。每組細(xì)胞均設(shè)置p SES-Ad-RFP腺病毒空載體感染進(jìn)行對(duì)照。5.本研究所有數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,并采用單因素方差分析的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 1.成功構(gòu)建腺病毒載體p SES-FGD6-si RNA,并完成病毒的擴(kuò)增及純化。2.細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示FGD6蛋白在肝干細(xì)胞HP14.5細(xì)胞中呈高表達(dá),主要定位在細(xì)胞核中。3.用腺病毒載體p SES-FGD6-si RNA感染HP14.5細(xì)胞,成功下調(diào)FGD6基因在HP14.5細(xì)胞中的表達(dá),同時(shí),AFP的mRNA及蛋白的表達(dá)降低,而Alb的mRNA及蛋白的表達(dá)升高(P0.01)。結(jié)論 抑制FGD6基因在肝干細(xì)胞HP14.5細(xì)胞中的表達(dá),可使HP14.5細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化。因此,FGD6基因?qū)Ω胃杉?xì)胞的分化可能起著重要的調(diào)控作用。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of FGD6(faciogenital dysplasia gene on the differentiation of hepatic stem cells. Method 1. The RNA interference target sequence of FGD6 gene was selected, the target fragment was cloned into shuttle vector p SES-HUS, and then transformed into receptive cells with skeleton plasmid p Adeasy-1, and then inoculated into kanamycin plate to select positive clones. The constructed plasmid was sequenced. The adenovirus vector was constructed by using Ad Easy system and the recombinant adenovirus vector p SES-FGD6-si RNA.3was amplified by sequencing. The expression and localization of FGD6 protein in HP14.5 cells of liver stem cells were detected by immunofluorescence assay. HP14.5 cells were infected with adenovirus vector p SES-FGD6-si RNA. The mRNA levels of FGD6, AFP and Alb) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The protein expression levels of FGD6 and Alb were detected by Western blot. Each group of cells were infected with empty vector of p SES-Ad-RFP adenovirus for control. 5. In this study, the data are expressed by the mean 鹵standard deviation (x 鹵s), and the statistical analysis of the data is carried out by using the method of univariate analysis of variance (ANOVA). Result 1. Adenovirus vector p SES-FGD6-si RNA was successfully constructed, and the amplification and purification of the virus. 2. 2. The results of cellular immunofluorescence assay showed that FGD6 protein was highly expressed in HP14.5 cells of liver stem cells, mainly located in the nucleus. HP14.5 cells were infected with adenovirus vector p SES-FGD6-si RNA, and the expression of FGD6 gene in HP14.5 cells was down-regulated, while the expression of mRNA and protein was decreased, while the expression of mRNA and protein of Alb was increased (P0.01). Conclusion inhibiting the expression of FGD6 gene in HP14.5 cells of liver stem cells can induce the differentiation of HP14.5 cells into hepatocytes. Therefore, FGD6 gene may play an important role in regulating the differentiation of hepatic stem cells.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575

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本文編號(hào)：1914482