本文選題：玉米 + 穗發(fā)芽　； 參考：《中國農業(yè)大學》2017年博士論文

【摘要】：玉米籽粒突變體是研究玉米種子發(fā)育的重要材料,對突變體基因的克隆和功能分析不僅可以了解玉米種子的發(fā)育機制,而且具有潛在的應用價值。到目前為止,國內外的研究人員已經對玉米籽粒突變體做了大量的研究工作。本實驗室之前已經利用玉米自交系B73與Mutator (Mu)活性系雜交,構建了一個玉米籽粒突變體庫,其中有多個符合3:1分離比的隱性突變體,本研究選取其中兩個玉米籽粒突變體進行基因克隆和功能分析,其中一個是玉米穗發(fā)芽突變體(vp-wl2),另外一個是玉米小粒突變體(smk-wl10)。,穗發(fā)芽突變體vp-wl2的種子呈灰白色,突變體種子成熟前在雌穗上萌發(fā),胚乳缺少正常的類胡蘿卜素組分,積累ζ-胡蘿卜素,ABA合成受阻。利用改進的DLA法克隆到引起vp-wl2突變體發(fā)生穗發(fā)芽的基因是玉米的ZDS基因(zeta-carotene desaturase gene)。vp-wl2突變體的ZDS基因在第一內含子和第二外顯子之間有一個Mu9轉座子的插入,導致該基因不能正常轉錄而發(fā)生突變。之前有研究認為ZDS基因可能是vp9突變體的結構基因,也有可能是vp9位點調控了 ZDS基因的表達,但是沒有直接的證據能證明二者的關系。為了證明二者的關系,將vp-wl2突變體和三個vp9突變體做了等位測驗,結果發(fā)現(xiàn),vp-wl2是vp9的一個新等位突變體,進而證明了vp 的結構基因是ZDS基因。已有研究表明,類胡蘿卜素主要在葉綠體中合成,利用玉米原生質體和煙草葉片對ZDS-YFP蛋白進行瞬時表達發(fā)現(xiàn),ZDS蛋白定位在葉綠體中。ZDS蛋白是類胡蘿卜素生物合成途徑中的一個關鍵酶,該蛋白在合成后會被運送到葉綠體中催化類胡蘿卜素的生物合成,因此,ZDS基因突變后會導致玉米籽粒缺少類胡蘿卜素,使ABA的合成受阻,ABA含量不足就不能維持胚在發(fā)育過程中的休眠狀態(tài),最終導致穗發(fā)芽的表型。smk-wll0是一個小粒突變體,大部分小種子的胚發(fā)育受阻,只有一小部分小種子能夠發(fā)芽,少數突變體在田間能散粉,但是不能形成正常的雌穗。通過觀察種子發(fā)育過程中的切片發(fā)現(xiàn),突變體的胚發(fā)育滯后,胚乳發(fā)育也不正常,胚乳基部轉移層細胞(BETL)不能形成向內生長的細胞壁,進而影響營養(yǎng)物質從母體向胚乳運輸。利用圖位克隆法將smk-wll0基因定位在玉米2號染色體短臂上433 kb的區(qū)間內,區(qū)間內有7個開放閱讀框,分別是ORF1到ORF7,在突變體中7個候選基因的DNA序列沒有發(fā)生改變,與B73的參考基因組一致。其中只有ORF2在突變體幼苗和種子中均不表達,其余候選基因在突變體和野生型中均表達,且表達差異不顯著。進一步研究發(fā)現(xiàn),ORF2的啟動子區(qū)CHG甲基化程度較高,經過分離群體的驗證發(fā)現(xiàn),啟動子區(qū)域的CHG甲基化程度與ORF2表達水平呈負相關關系。ORF2編碼微管蛋白折疊輔助因子B,擬南芥中該基因的直系同源基因突變會引起胚致死,因此,推測ORF2是smk-wllD的候選基因。以上的實驗結果表明,玉米ZDS基因突變后會阻斷類胡蘿卜素的生物合成,導致ABA含量降低,進而出現(xiàn)穗發(fā)芽的表型;玉米微管蛋白折疊輔助因子B基因的不表達很可能會導致玉米種子發(fā)育受阻,影響籽粒的正常生長。這些發(fā)現(xiàn)為我們解析玉米籽粒的發(fā)育過程提供了新的實驗證據。
[Abstract]:Maize seed mutants are important materials to study the development of maize seed. Cloning and functional analysis of mutant genes can not only understand the mechanism of maize seed development, but also have potential application value. So far, researchers at home and abroad have done a lot of research on maize seed mutants. A maize seed mutant library was constructed by hybridization between maize inbred line B73 and Mutator (Mu). There were multiple recessive mutants which were in line with 3:1 separation ratio. Two of the maize seed mutants were selected for gene cloning and functional analysis. One of them was the maize ear sprout mutant (vp-wl2), and the other one was the other one. It is a small corn mutant (smk-wl10). The seed of the mutant vp-wl2 of the panicle is gray. The mutant seeds germinate on the female ear before maturity. The endosperm lacks normal carotenoid components, the zeta carotene accumulation is accumulated, and the ABA synthesis is blocked. The ZDS based gene of the maize is cloned by the improved DLA method. The ZDS gene of the (ZETA-Carotene desaturase gene).Vp-wl2 mutant has an insertion of a Mu9 transposon between the first intron and the second exon, causing the gene to be mutated without normal transcription. Previous studies suggest that the ZDS gene may be the structural cause of the VP9 mutant and may also regulate the ZDS gene at the VP9 site. But there is no direct evidence to prove the relationship between the two. In order to prove the relationship between the two, the vp-wl2 mutant and the three VP9 mutants were tested. The results showed that vp-wl2 was a new allele of VP9, and that the structural gene of VP was a ZDS gene. ZDS-YFP protein was instantaneously expressed by maize protoplasts and tobacco leaves. The ZDS protein was located in the chloroplast as a key enzyme in the carotenoid biosynthesis pathway, and the protein was transported to the chloroplast to catalyze the biosynthesis of the catalyzed Hu Luo dopa in the chloroplast. Therefore, the ZDS gene mutation will result in the mutation of the ZDS gene. There is a lack of carotenoid in corn grain, which makes the synthesis of ABA hindered, and the lack of ABA content can not maintain the dormancy state of the embryo during the development of the embryo. Finally, the phenotypic.Smk-wll0 of the bud germination is a small grain mutant, and the embryo development of most small seeds is blocked, only a small fraction of the seed can germinate and a few mutants can be in the field. Powder, but can not form normal female ear. By observing the slicing in the process of seed development, it is found that the embryo development of the mutant is lagging behind and the endosperm development is not normal. The endosperm base transfer layer cells (BETL) can not form the inward cell wall, and then affect the transport of nutrients from the mother to the endosperm. The smk-wll0 base is used by the map cloning method. In the interval of 433 KB on the short arm of chromosome 2, there were 7 open reading frames in the interval, which were ORF1 to ORF7, and the DNA sequence of the 7 candidate genes in the mutant did not change, which was consistent with the reference genome of B73. Only ORF2 was not expressed in the mutant seedlings and seeds, and the other candidate genes were in the mutant and in the mutant. Further studies found that the degree of CHG methylation in the promoter region of ORF2 was higher. It was found that the degree of CHG methylation in the promoter region was negatively related to the level of ORF2 expression,.ORF2 encoded microtubulin folding cofactor B, and the direct homologous of this gene in Arabidopsis thaliana. Gene mutation can cause death of the embryo, so ORF2 is a candidate gene for smk-wllD. The above results show that the mutation of the maize ZDS gene will block the biosynthesis of carotenoid, which leads to the decrease of the ABA content and then the phenotype of the spike germination, and the non expression of the maize microtubulin fold auxiliary factor B gene may lead to the corn. These findings provide new experimental evidence for our understanding of the development of maize seeds.
【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S513

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本文編號：1905213