本文選題：ZFY基因 + 性別控制�。� 參考：《石河子大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：ZFY (zinc finger-Y)基因是從Y染色體上分離而來,它是在尋找Y染色體上促雄性發(fā)育基因時發(fā)現(xiàn)的第一個基因,并被認(rèn)為是可能的睪丸決定因子,其編碼的蛋白質(zhì)通過一個“鋅指”結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合,從而調(diào)控其他基因的表達(dá),在精子的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。早期為了驗(yàn)證ZFY基因是最主要的睪丸決定因子這一假設(shè),研究內(nèi)容大都聚焦于性腺發(fā)育過程中ZFY基因在胚胎中的表達(dá)。隨著這一假設(shè)被Palmer MS等否定及人和小鼠中睪丸決定因子SRY的發(fā)現(xiàn),對ZFY的研究逐漸退卻,僅有部分研究將ZFY和ZFX基因用于性別鑒定的研究。但最新的研究結(jié)果表明在精子發(fā)生過程中也有ZFY基因的表達(dá),并且已經(jīng)證實(shí)在進(jìn)入減數(shù)分裂時ZFY基因的表達(dá)量會增加,而且其另一個重要的作用就是確保第二次減數(shù)分裂的發(fā)生,使雄性個體產(chǎn)生正常的單倍體精子,其等位基因ZFX具有協(xié)助作用。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是普遍存在于動植物體內(nèi)、高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)介導(dǎo)的誘發(fā)同源nRNA特異性降解的基因沉默現(xiàn)象。經(jīng)過近二十年的不斷發(fā)展,RNAi以其特異性、高效性及穩(wěn)定性已經(jīng)成為功能基因研究領(lǐng)域的主要研究工具。為探究ZFY基因在豬性別控制中的作用,本研究以豬ZFY基因?yàn)檠芯繉ο?運(yùn)用RNAi的方法,構(gòu)建豬ZFY基因干擾載體,并通過體外細(xì)胞水平進(jìn)行干擾載體的篩選,然后進(jìn)行動物體內(nèi)試驗(yàn),以期待獲得更多的雌性后代,然后根據(jù)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,探討ZFY基因在豬性別控制中的相關(guān)作用。具體研究及結(jié)果如下：1、豬ZFY基因shRNA干擾序列的設(shè)計(jì)及重組表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)Ensemble中豬ZFY基因序列信息(登錄號ENSSSCT00000013323)及siRNA設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)并合成9對shRNA序列,然后與慢病毒骨架載體pLentiLox3.7 (pLL3.7)進(jìn)行重組,構(gòu)建了9個針對豬ZFY基因的重組表達(dá)載體shRNA-1～shRNA-9,測序結(jié)果顯示,9對shRNA序列均正確插入pLL3.7中,說明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。2、豬ZFY基因shRNA重組表達(dá)載體干擾效率的檢測(細(xì)胞水平)：將構(gòu)建好的shRNA重組表達(dá)載體干擾體外培養(yǎng)的豬生精細(xì)胞,qRT-PCR檢測生精細(xì)胞中ZFY基因的表達(dá),shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3對ZFY基因的表達(dá)沒有抑制效果,shRNA-4～shRNA-9對ZFY基因的抑制效率分別為：30%、33%、33%、44%、66%和89%,與對照組相比差異均顯著(P0.05)。3、豬ZFY基因shRNA重組表達(dá)載體的體內(nèi)RNAi試驗(yàn)選擇對ZFY基因抑制效率較高、特異性較強(qiáng)的shRNA-5重組表達(dá)載體和shRNA-9重組表達(dá)載體進(jìn)行豬ZFY基因的體內(nèi)RNAi試驗(yàn)。選取4頭長白公豬,分為A、B兩組,每組2頭公豬,A組公豬注射重組質(zhì)粒shRNA-5,B組公豬注射重組質(zhì)粒shRNA-9,每頭公豬注射劑量為3mg(每側(cè)睪丸1.5mg),每10天注射1次,共注射3次,第3次注射后3天開始配種,對照組公豬不進(jìn)行注射。結(jié)果顯示：截止到最后一針注射后30天,對照組共配16頭母豬,共產(chǎn)仔豬146頭,其中母豬比例為56.16%；A組公豬共配16頭母豬,共產(chǎn)仔豬152頭,雌性比例為34.87%,與對照組相比差異極顯著(P0.01),B組公豬共配16頭母豬,共產(chǎn)仔豬144頭,其中母豬比例為47.22%,與對照組相比差異不顯著(P0.05)。A組和B組均出現(xiàn)與預(yù)期相反的性別偏移,雖然未能獲得預(yù)期性別的仔豬,但這也充分說明了ZFY基因在動物性別決定過程中的作用,其相關(guān)作用機(jī)理及本實(shí)驗(yàn)中性別反向偏移的原因還需進(jìn)-步深入研究。另外,A、B兩組的平均窩產(chǎn)仔豬數(shù)與對照組相比,差異不顯著,說明采用RNAi的方法對多胎動物進(jìn)行性別控制,對動物的受胎率、繁殖率等都沒有不利影響。
[Abstract]:In order to study the role of ZFY gene in the sex control of pigs , the research results are as follows : 1 . The expression of ZFY gene in pig ' s sex control has been studied . The effects of shRNA - 1 , shRNA - 2 and shRNA - 3 on ZFY gene expression did not inhibit the expression of ZFY gene . shRNA - 1 , shRNA - 2 and shRNA - 3 showed no effect on ZFY gene expression .
Compared with the control group , there was no significant difference between group A and group B ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78

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本文編號：1896229