本文選題：性分化異常疾病 + 目標序列捕獲��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2016年博士論文

【摘要】：人類生殖系統(tǒng)發(fā)育是一個動態(tài)過程,始于胚胎時期,在青春期出現(xiàn)第二性征并獲得生殖能力。整個過程,需要多種基因、蛋白、信號分子以及內(nèi)分泌激素,進行復雜而精確地配合才能完成。任何影響和阻礙這個進程的因素都可能導致性腺發(fā)育異常、外生殖器模糊和生殖能力下降,造成多種疾病狀態(tài)。性分化異常疾病(DSD)是臨床疑難雜癥之一。其中46,XY DSD病情尤為復雜,對其診斷和治療一直是難點。本文第一部分,應用目標序列捕獲測序技術檢測46,XY DSD患者的致病基因,嘗試對疾病進行準確、高效的基因?qū)W診斷。本研究同時分析患者基因型與表型相關性,為揭示深層次的發(fā)病機制以及性別決定／分化的生理過程提供線索和依據(jù),并指導臨床診治。先天性低促性腺激素性性腺功能減退癥(CHH)是導致青春發(fā)育延遲生殖能力下降的常見病因。由于發(fā)病率低,對其生精治療的預后影響因素缺乏大樣本研究數(shù)據(jù)。本文第二部分,分析大樣本量CHH患者應用促性腺激素治療的生精療效及其預測因素,為此病生精治療的療效提供循證醫(yī)學證據(jù),提升臨床診治水平。第一部分：應用目標序列捕獲測序技術篩查46,XY性分化異常疾病的致病基因[背景]正常情況下,染色體核型為46,XY的人類胚胎在孕第4-5周時形成具有雙向潛能的尿生殖嵴；胚胎發(fā)育第7-8周,原始性腺向睪丸分化,Sertoli細胞和Leydig細胞相繼發(fā)育并分別分泌抗Mullerian管因子(AMH)和睪酮、胰島素樣因子3 (INSL3)。睪酮和AMH共同導致Mullerian管結構退化,促進Wolffian管發(fā)育為附睪、輸精管、精囊；INSL3則促進睪丸的下降。睪酮通過5a還原酶轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮,二者均作用于雄激素受體進而產(chǎn)生一系列生物學效應。任何影響了睪丸分化、睪酮合成或作用的因素,都可以導致46,XY性分化異常疾病(Disorders of sex development, DSD)的形成。46, XY DSD是指染色體核型為46,XY,但雄激素合成或作用缺陷,導致外生殖器模糊不清或呈女性外生殖器的一類先天性疾病。該疾病的遺傳背景復雜,涉及基因廣泛,臨床醫(yī)生了解較少。目前已明確與46, XY DSD致病有關的基因至少有30種。不同致病基因?qū)е碌?6,XY DSD可有不同的伴隨癥狀,嚴重程度不一,相應的治療方式有所不同。即使是相同的基因突變,外生殖器的表型也可呈現(xiàn)很大差異。所以盡早明確分子診斷對于臨床診治、了解疾病預后及產(chǎn)前咨詢至關重要。既往針對多個基因進行傳統(tǒng)的Sanger測序,往往耗時費力,成本高效率低。近些年快速發(fā)展的目標序列捕獲測序技術具有針對性強、費用低、效率高等特點。采用目標序列捕獲測序?qū)Α?6, XY DSD患者進行遺傳學研究,可快速明確其分子診斷并提高突變的總體檢出率。進一步分析和總結不同致病基因?qū)е碌?6, XY DSD患者的臨床特點,建立46, XY DSD患者資料庫,可增加對本病發(fā)病機制的認識,提高臨床診治水平。[口的]1.總結46, XY DSD患者的臨床特點。2.篩查和檢測46, XY DSD患者的致病基因。3.分析46, XY DSD患者基因型與表型相關性。[對象和方法]1.研究對象：2014年3月至2015年10月就診于北京協(xié)和醫(yī)院的63例46, XY DSD患者(除外孤立性陰莖頭型尿道下裂、孤立性小陰莖、孤立性隱睪)。2.研究方法：(1)臨床研究：收集46, XY DSD患者臨床資料,總結其臨床特點。(2)基因研究：采用目標序列捕獲結合二代測序的方法檢測46, XY DSD患者的性腺分化和發(fā)育相關的299個基因。將檢出的可疑致病突變(Sanger測序驗證后)與已知數(shù)據(jù)庫進行比對,并利用SIFT、Polyphen-2和Mutation taster軟件對新發(fā)突變位點進行功能預測。(3)表型和基因型相關性研究：總結不同基因突變導致的46, XY DSD患者的臨床特點,探討表型與基因型的相關性。[結果]1.本研究共納入63例46, XY DSD患者,其中49/63(78%)例社會性別為女性,12/63例(19%)有類似疾病家族史。青春啟動前就診的患者(n=34)中24/34(71%)例按社會性別女性撫養(yǎng),其中12例因外生殖器畸形就診,12例因陰唇或腹股溝包塊就診；10/34(29%)例患者以社會性別男性撫養(yǎng),均以外生殖器畸形為主訴就診。青春啟動后就診的患者(n=29)中25/29(86%)例按照社會性別女性撫養(yǎng),其中19例因原發(fā)性閉經(jīng)就診,5例因青春期雄性化就診,1例因身材矮小篩查染色體發(fā)現(xiàn)與表型性別不符就診；4/29(14%)例患者按照社會性別男性撫養(yǎng),其中2例以外生殖器畸形就診,2例以男性乳房發(fā)育為主訴就診。影像學檢查提示50/63(79%)例患者存在睪丸或睪丸樣組織,14/59(24%)例患者有子宮。明確為46, XY DSD后,青春啟動前就診的患者性別轉(zhuǎn)換率(由社會性別女性轉(zhuǎn)換為男性或反之)為8/24(33%)；青春啟動后就診患者性別轉(zhuǎn)換率為2/25(8%)。2.研究中有48例患者檢出致病基因突變,檢出率為76%(48/63)；共檢出8種致病基因的48處突變位點,有30處為新發(fā)突變。其中16(16/63,25%)例檢測出AR基因突變；10(10/63,16%)例檢測出SRD5A2基因突變；13(13/63,21%)例檢測出1VR5A1基因突變；3(3/63,5%)例存在.HSD17B3基因突變；3(3/63,5%)例存在SRY基因突變；1(1/63,2%)例MAP3K1基因突變；1(1/63,2%)例POR基因突變；1(1/63,2%)例CYP17A1基因突變。3.AR、SRD5A2和NR5A1三種基因突變導致146,XY DSD的患者有39例,比例高達62%(39/63)。AR基因突變組與SRD5A2基因突變組患者血睪酮水平(青春期前測定HCG興奮后水平)無顯著性差異(P=0.976),但均明顯高于NR5A1基因突變組(P值分別為0.001,=0.022)。前2組患者均可觸及腹股溝或陰唇包塊/陰囊內(nèi)睪丸,均未見子宮；NR5A1基因突變組僅54%(7/13)可觸及腹股溝或陰唇包塊/陰囊內(nèi)睪丸,38%(5/13)的患者可見子宮。有6例AR基因突變患者經(jīng)歷了青春期,均有乳房發(fā)育,有1例同時有雄性化表現(xiàn),LH平均為(10.8±3.2)IU/L,FSH(7.0±6.7)IU/L;4例SRD5A2基因突變患者經(jīng)歷青春期,均無乳房發(fā)育,其中2例有雄性化表現(xiàn),LH(12.6±4.1)IU/L,FSH(15.1±8.9)IU/L;NR5A1基因突變患者中有8例經(jīng)歷青春期,3例有乳房發(fā)育,3例出現(xiàn)雄性化表現(xiàn),LH(50.4±45.6)IU/L,FSH(38.9±27.1) IU/L。[結論]1.對于社會性別為女性的46,XY DSD患者,青春期前就診者多以腹股溝／陰唇包塊或外生殖器畸形為主訴；青春期后就診者多以雄性化或原發(fā)性閉經(jīng)為主訴。社會性別男性患者多以外生殖器畸形或青春期乳房發(fā)育就診。2.本研究中,76%的46,XY DSD患者檢測出8種致病基因突變,48處突變位點,其中30處為新發(fā)突變。與既往研究相比,目標序列捕獲測序技術可明顯提高致病基因突變檢出率,是鑒定46,XY DSD致病基因的有效方法。3.本研究中,46,XY DSD患者以AR、SRD5A2、NR5A1基因突變最為常見。其中AR、SRD5A2基因突變導致雄激素作用缺陷,是臨床常見病因；但也要警惕引起雄激素合成缺陷的NR5A1基因突變。4.AR基因突變組與SRD5A2基因突變組患者均存在睪丸或睪丸樣組織,無子宮,血睪酮水平明顯高于NR5A1基因突變組。經(jīng)歷青春期的AR基因突變患者均有乳房發(fā)育,SRD5A2基因突變患者無乳房發(fā)育但出現(xiàn)雄性化的比例較高,NR5A1基因突變患者促性腺激素水平明顯升高。這為46,XY DSD患者的臨床診斷、鑒別診斷、性別選擇及后續(xù)治療,提供了重要的證據(jù)。第二部分應用促性腺激素治療先天性低促性腺激素性性腺功能減退(CHH)患者的生精療效及影響因素分析[背景]先天性低促性腺激素性性腺功能減退癥(Congenital Hypogonadotropic Hypogonadism, CHH),是由于下丘腦GnRH分泌或作用缺陷而導致的一類疾病。GnRH缺乏,導致垂體分泌促性腺激素不足,進而引起睪丸產(chǎn)生雄激素不足和生精障礙。根據(jù)是否合并存在嗅覺障礙,該類疾病可分為有嗅覺障礙的Kallmann綜合征和嗅覺正常的CHH (normosmic Congenital Hypogonadotropic Hypogonadism, nCHH)。 CHH的總發(fā)病率約為1/8,000-10,000,男女比例約5：1。對于有生育需求的男性患者,促性腺激素治療有助于促進睪丸發(fā)育、睪酮合成和精子生成。CHH發(fā)病率較低,因此關于其生精療效的研究,國內(nèi)外缺乏大樣本研究數(shù)據(jù)。目前,不同研究對促性腺激素生精療效及影響因素的研究結論尚不完全一致。本研究共納入應用絨促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)聯(lián)合尿促性腺激素(human menopausal gonadotropin, HMG)促進生精治療的223例男性CHH患者。研究旨在通過大樣本分析促性腺激素生精治療CHH患者的療效及其影響因素,為臨床開展生精治療提供更多循證醫(yī)學證據(jù)。[目的]1.分析CHH患者應用HCG聯(lián)合HMG生精治療的療效,并尋找影響CHH患者精子產(chǎn)生的預測指標。2.分析伴隱睪的CHH患者應用HCG聯(lián)合HMG生精治療的療效。[對象和方法]1.研究對象：2005年1月至2014年12月就診于北京協(xié)和醫(yī)院的男性CHH患者223例(其中伴有隱睪者40例)。2.研究方法：回顧性分析。3.治療及隨診方案：所有患者給予HCG (2000-5000U,肌肉注射,每周2次)聯(lián)合HMG (75-150U,肌肉注射,每周2次)治療至少6個月。每3-6個月隨診1次,測定性激素水平、睪丸體積變化、精子生成情況,記錄患者妻子妊娠和生育情況。[結果]1.CHH患者(n=223)平均隨診時間為23±13個月�；颊叱踉\時的睪酮(0.9±0.5)nmol/1,睪丸體積(取兩側體積的平均值)(2.1±1.6)ml。治療后末次隨診睪酮(15.1±8.2)nmol/1(和治療前相比明顯升高,P0.001)；末次隨診時,睪丸體積(8.1±4.6)ml(和治療前相比,睪丸體積明顯增大,P0.001)。所有患者預測的精子初現(xiàn)中位治療時間為15個月[95%可信區(qū)間(confidence interval, CI) 13.5-16.5]�；颊叱踉\時睪丸體積大(P=0.012)、無隱睪史(P=0.028),是精子初現(xiàn)時間縮短的重要影響因子。共143例(143/223,64%)患者成功產(chǎn)生精子,平均精子初現(xiàn)時間為(14±8)個月�；A睪丸體積(p=-1.074,P=0.003)、隱睪史(p=3.457,P=0.004)、開始生精治療年齡(p=-0.445,P=0.002)是影響精子初現(xiàn)時間的重要預測因素。有精子生成的患者中,34例患者有生育需求,有19/34例(56%)患者的配偶共妊娠20次。2.40例伴有隱睪的CHH患者平均隨診24(15,33)個月,預測的精子初現(xiàn)中位時間為24個月(95%CI 17.8-30.2)。其中20例(20/40,50%)患者成功生成精子,9例已婚且有生育需求的患者中有5例(5/9,56%)成功孕育下一代。3.與不伴隱睪的CHH患者相比,隱睪患者精子初現(xiàn)中位治療時間更長(24個月 vs.15個月,P0.001),生精成功率更低(50% vs.67%,P=0.032),生精成功者的末次隨診平均精子密度更低[1.9(0.5,8.6)百萬/nl vs.11.1(1.0,25.0)百萬/ml,P=0.006]。[結論]1.促性腺激素可有效促進CHH患者精子生成�；A睪丸體積和隱睪史是影響生精成功治療時間的主要因素。2.盡管隱睪史是生精治療的不利因素,伴隱睪的CHH患者經(jīng)過促性腺激素治療后仍有一半可成功生成精子。雖然生精時間明顯延長,精子密度較低,但其配偶仍然存在受孕的機會。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R588
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本文編號：1894948