本文選題：丹參 + 漆酶�。� 參考：《福建中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：丹參(Salvia Miltiorrhiza Bunge)為唇形科鼠尾草屬植物,其根及根莖入藥,主要用于治療心血管疾病。課題組前期通過(guò)同位素示蹤發(fā)現(xiàn)迷迭香酸(RA)是合成丹參酚酸B(LAB)的重要前體[2],并推測(cè)丹參漆酶是催化RA在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)化形成LAB的關(guān)鍵酶。本課題目的在于驗(yàn)證這個(gè)推測(cè),并初步探索丹參漆酶基因家族在酚酸類(lèi)代謝途徑中的功能與作用。我們從丹參基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了丹參漆酶并借助各種手段進(jìn)行篩選獲得了目標(biāo)漆酶基因,在體外和體內(nèi)探索了其在丹參酚酸代謝途徑中的作用。本文主要從以下幾個(gè)方面對(duì)丹參漆酶的體內(nèi)、體外功能進(jìn)行研究:1.以RA為底物,使用商品化的漆樹(shù)漆酶進(jìn)行催化反應(yīng),在產(chǎn)物中檢測(cè)到了少量的LAB。該結(jié)果初步驗(yàn)證了植物漆酶在體外具有催化RA生成LAB的能力。2.借助生物信息學(xué)分析方法,我們對(duì)丹參基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了充分的挖掘。將NCBI上的已有漆酶基因序列與丹參基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),篩選得到29條完整的丹參漆酶(Smlacs)序列,并對(duì)它們進(jìn)行了理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、氨基酸同源性等特征分析。初步篩選得到15條可能具有該催化功能的Smlacs。3.我們考察了 29條Smlacs在植物中的組織特異性和受甲基茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)情況。結(jié)果顯示15條Smlacs中同時(shí)滿足MeJA誘導(dǎo)能夠調(diào)控其表達(dá)量升高和丹參根中表達(dá)量相對(duì)其他部位較高兩個(gè)條件的丹參漆酶有三條,它們分別是Smlac7、Smlac20和Smlac28。因此,本課題將這三條基因作為候選基因進(jìn)行體外功能和體內(nèi)功能的研究。4.通過(guò)合適的引物進(jìn)行PCR反應(yīng),獲得了 3條目的漆酶基因;在畢赤酵母表達(dá)體系中進(jìn)行了蛋白表達(dá);已經(jīng)完成了畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建,并成功轉(zhuǎn)入了GS115宿主細(xì)胞中,使用抗性篩選獲得了 His+菌株。目前蛋白還在進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)當(dāng)中。5.利用RNAi技術(shù)獲得了三個(gè)Smlacs的轉(zhuǎn)基因發(fā)根。使用RT-PCR和qPCR技術(shù)對(duì)發(fā)根進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明陽(yáng)性發(fā)根中的目的基因的表達(dá)量與空載對(duì)照組發(fā)根中該基因表達(dá)量相比明顯降低,說(shuō)明目的基因的表達(dá)成功的被抑制了。轉(zhuǎn)基因發(fā)根與空白對(duì)照組之間在形態(tài)也出現(xiàn)了差異。利用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因發(fā)根進(jìn)行RA和LAB的含量測(cè)定。結(jié)果顯示三種轉(zhuǎn)基因發(fā)根中LAB的含量均有不同程度的下降,三種轉(zhuǎn)基因發(fā)根RA的含量較空白對(duì)照組均有略微的上升。該結(jié)果表明三個(gè)漆酶均能夠影響LAB在體內(nèi)的合成;6.通過(guò)在轉(zhuǎn)基因丹參發(fā)根中過(guò)量表達(dá)Smlac7和Smlac20,對(duì)其調(diào)控作用進(jìn)行進(jìn)一步確證。RT-PCR和qPCR技術(shù)表明陽(yáng)性發(fā)根中的目的基因的表達(dá)量均有不同程度的提高。同時(shí),檢測(cè)發(fā)根中LAB和RA的含量,結(jié)果表明LAB的含量明顯高于空白對(duì)照組,而RA的含量并未出現(xiàn)明顯的下降。該結(jié)果表明過(guò)表達(dá)兩個(gè)漆酶基因?qū)Πl(fā)根中丹參酚酸B的含量均有明顯的提高,可以作為代謝調(diào)控丹參迷迭香酸和丹參酚酸B合成的一種新方法。綜上所述,本研究在體外驗(yàn)證了漆酶具有催化RA生成LAB功能的前提下,通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)丹參漆酶進(jìn)行篩選,并對(duì)具有潛在功能的三條丹參漆酶進(jìn)行了體內(nèi)和體外功能的驗(yàn)證,首次探索了漆酶與丹參水溶性有效成分迷迭香酸及丹參酚酸B在植物次生代謝中的內(nèi)在聯(lián)系,擴(kuò)展了人們對(duì)漆酶在調(diào)控次生代謝產(chǎn)物方面的認(rèn)識(shí),為闡明丹參體內(nèi)丹酚酸B合成途徑,進(jìn)一步開(kāi)展以生物合成途徑為基礎(chǔ)的遺傳改造、培育優(yōu)良品系提供了理論基礎(chǔ)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提醒我們對(duì)于丹參漆酶家族中其它可能參與酚酸代謝途徑的基因還有待于進(jìn)行全面探索。
[Abstract]:Salvia miltiorrhiza (Salvia Miltiorrhiza Bunge) is a plant of the genus salvia in the lip family. Its roots and rhizomes are used as medicine for the treatment of cardiovascular diseases. In the early stage of the study, we found that rosmarinic acid (RA) was an important precursor to the synthesis of salvianolic acid B (LAB) by isotopic tracers, and that laccase was the key enzyme to catalyze the transformation of RA in plants to form LAB. The subject of this lesson is to verify this speculation, and to explore the function and function of the salvia miltiorrhiza gene family in the phenolic acid metabolism pathway. We obtained the laccase from Danshen genome database and screened the target laccase gene by means of various means. In vitro and in vivo, we explored its phenolic acid pathway in Salvia miltiorrhiza. The function in vivo and in vitro is studied in the following aspects: 1. using RA as the substrate and using commercialized laccase for laccase, a small amount of LAB. has been detected in the product, and the result preliminarily verifies the ability of plant laccase to catalyze RA to produce LAB in vitro.2. with the help of biological letter. We have fully excavated the genomic data of Salvia miltiorrhiza, and compared the existing laccase gene sequences on NCBI with the Danshen genome database, and screened 29 complete Smlacs sequences, and analyzed their physicochemical properties, egg white structure, amino acid homology and so on. 15 Smlacs.3., which may have the function of this catalysis, we examined the tissue specificity of 29 Smlacs in plants and the induction of methyl jasmonate (MeJA). The results showed that 15 Smlacs were able to satisfy the MeJA induction to regulate the increase of its expression and the two conditions higher in the root of the root of Salvia miltiorrhiza than in the other parts. There are three elements of the ginseng laccase, which are Smlac7, Smlac20 and Smlac28.. Therefore, the three genes were used as candidate genes for in vitro function and in vivo function..4. was obtained by PCR reaction with appropriate primers, and 3 laccase genes were obtained. The construction of yeast expression vector has been successfully transferred into GS115 host cells, and His+ strain is obtained by resistance screening. The protein is still further induced by.5. using RNAi technology to obtain three Smlacs transgenic roots. Using RT-PCR and qPCR techniques to identify the roots, and the results indicate the target base in the positive root. The expression of the gene was significantly lower than that in the no-load control group, indicating that the expression of the target gene was suppressed. The morphological differences between the transgenic root and the blank control group were also different. The content of RA and LAB in the transgenic rooting was measured by LC-MS/MS technology. The results showed that three kinds of transgenic hair roots were found. The content of LAB decreased in varying degrees. The content of three transgenic roots RA increased slightly in comparison with that of the blank control group. The results showed that three laccase could affect the synthesis of LAB in the body. 6. through overexpression of Smlac7 and Smlac20 in the root of transgenic Salvia miltiorrhiza, the regulation effect was further confirmed by.RT-PCR and qPCR technology. The expression of the target gene in the positive root was improved in varying degrees. At the same time, the content of LAB and RA in the hair root was detected. The results showed that the content of LAB was obviously higher than that of the blank control group, while the content of RA was not obviously decreased. The results showed that the content of two laccase based on the content of B in the root of salvianolic acid in the root were obvious. It can be used as a new method to regulate the synthesis of Salvia miltiorrhiza and salvianolic acid B by metabolic regulation. To sum up, this study shows that laccase has the function of catalyzing RA to produce LAB in vitro. By bioinformatics method, the laccase of Salvia miltiorrhiza is screened by bioinformatics, and three laccase with potential function have been carried out in vivo. The internal relationship between laccase and Salvia miltiorrhiza and salvianolic acid B in the secondary metabolism of plants was first explored, and the understanding of laccase in the regulation of secondary metabolites was expanded for the first time, and the synthesis pathway of salvianolic acid B in Salvia miltiorrhiza was clarified, and the biosynthesis pathway was further carried out. The basis of genetic modification and breeding of fine lines provides a theoretical basis. At the same time, the experimental results also remind us of other genes in the family of Salvia miltiorrhiza laccase that may be involved in phenolic acid metabolic pathways in a comprehensive way.

【學(xué)位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S567.53

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本文編號(hào)：1857457