本文選題：S100A8 + 慢病毒載體��； 參考：《蘇州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：越來越多的研究表明慢性炎癥會增加惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(即:炎癥誘發(fā)腫瘤),近年來炎癥因子參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制研究成為新的熱點。作為炎性因子家族蛋白的成員之一,S100蛋白家族成員與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)S100A8與胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、甲狀腺癌、乳腺癌和皮膚癌等關(guān)系密切,提示其腫瘤性作用。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn),在成人初發(fā)急性髓細胞性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)病人中,S100A8基因在轉(zhuǎn)錄水平高表達的患者生存期短。在兒童AML,S100A8的表達水平具有評估早期治療反應(yīng)的作用。本試驗擬通過構(gòu)建S100A8慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染急性髓細胞性白血病細胞株HL-60,研究S100A8對HL-60細胞生物學(xué)特性的影響和藥物反應(yīng),探討S100A8在HL-60細胞中的作用機制。第一部分 構(gòu)建S100A8慢病毒載體及慢病毒的包裝目的:構(gòu)建S100A8慢病毒載體并包裝慢病毒顆粒,為該基因在AML的生物學(xué)作用及對化療藥物耐藥作用中的研究奠定基礎(chǔ)。方法:以正常人BMMC cDNA為模板,克隆出S100A8全長cDNA并裝載入pMD19-T載體中后進行測序鑒定。將測序正確的陽性克隆中的S100A8片段裝載入目的載體pLVX-IRES-puro中,篩選陽性克隆后進行雙酶切、PCR及測序鑒定。利用磷酸鈣沉淀法,將過表達載體與病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞,分別收集病毒上清。結(jié)果:成功克隆出的S100A8片段,并構(gòu)建到了p LVX-IRES-puro中,稱為pLVX-S100A8。將過表達載體與病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝慢病毒顆粒。結(jié)論:成功構(gòu)建S100A8慢病毒載體,并且包裝出慢病毒顆粒。第二部分 S100A8基因在HL-60細胞中穩(wěn)定表達及其生物學(xué)功能研究目的:S100A8在AML細胞株HL-60穩(wěn)定表達后,觀察S100A8對HL-60細胞增殖、凋亡、細胞周期、遷移及侵襲的影響。方法:1.實驗分組:空載體對照組(p LVX-control)以及高表達S100A8實驗組(p LVX-S100A8);2.收集實驗組和對照組細胞,分別制備成c DNA及蛋白,采用實時熒光定量RT-PCR和Western Blot分析S100A8在轉(zhuǎn)染細胞中的m RNA和蛋白表達水平;3.CCK-8方法測定細胞活力,繪制生長曲線,觀察S100A8對HL-60細胞增殖的影響;4.利用FCM檢測S100A8對HL-60細胞周期和凋亡的影響;5.利用Transwell小室觀察兩組細胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果:1.q RT-PCR和Western Blot檢測兩組細胞結(jié)果顯示,S100A8在轉(zhuǎn)染了p LVX-S100A8細胞中的表達顯著強于其在對照細胞中的表達量;2.實驗組與對照組相比,高表達S100A8對HL-60細胞的增殖、凋亡無明顯差異(P0.05);3.體外跨膜實驗結(jié)果顯示,高表達S100A8實驗組(p LVX-S100A8)細胞株的侵襲能力比對照組明顯增加(0.701±0.058 Vs 0.289±0.032,p0.0001);而遷移能力兩組之間無顯著差異(P0.05)。結(jié)論:外源性上調(diào)S100A8促進HL-60體外侵襲能力,但對于細胞的增殖、凋亡及遷移無影響。第三部分 過表達S100A8基因促進HL-60細胞對足葉乙甙耐藥的機制探討目的:研究S100A8過表達的AML細胞株HL-60對臨床常規(guī)化療藥物(足葉乙甙、阿霉素、阿糖胞苷以及高三尖杉酯堿)的耐藥性,并對其機制進行初步探討。方法:1.用足葉乙甙、阿霉素、阿糖胞苷、高三尖杉酯堿作用HL-60細胞,CCK-8法檢測細胞抑制率,觀察S100A8基因?qū)λ幬锩舾行缘挠绊?2.用300ng/ml濃度的足葉乙甙(VP-16)處理實驗組和空載組細胞72h,取兩組細胞行FCM,分析細胞周期和凋亡的變化;3.收集300ng/ml足葉乙甙濃度處理的兩組細胞,制備成c DNA,用PCR Aarry的方法分析兩組細胞的差異表達基因;4.用Western Blot驗證Bcl-2、Caspasce-3和Bax基因在兩組細胞中蛋白表達水平變化情況。結(jié)果:1.藥物實驗顯示,高表達S100A8增加了HL-60細胞對VP-16耐藥性(p0.0001);而對阿霉素、阿糖胞苷、高三尖杉酯堿的敏感性無明顯影響(P0.05);2.VP-16處理兩組細胞后,p LVX-S100A8組的凋亡比率顯著低于p LVX-control組細胞(p0.05),而兩組細胞的周期比例沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);3.凋亡PCR Array實驗結(jié)果顯示,S100A8高表達組和空載組比較有48個差異表達基因,發(fā)現(xiàn)被上調(diào)的有12基因,下調(diào)的有36個基因;4.Western Blot結(jié)果顯示Caspasce-3和Bax的表達被下調(diào),而Bcl-2的表達沒有變化。結(jié)論:S100A8的高表達可以引起AML細胞株HL-60對臨床常規(guī)化療藥物足葉乙甙的顯著耐藥,其機制可能是通過下調(diào)線粒體凋亡途徑實現(xiàn)的。
[Abstract]:In this study , it was found that in the patients with acute myeloid leukemia ( AML ) , the expression level of S100 protein was shorter than that of cancer , colon cancer , pancreatic cancer , bladder cancer , ovarian cancer , thyroid cancer , breast cancer and skin cancer . The results showed that the proliferation of HL - 60 cells was significantly higher than that in the control group ( P < 0.05 ) . Results : 1 . The expression of Bcl - 2 , Caspasce - 3 and Bax was significantly lower than that of p - LVX - control group ( P < 0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2;R364.5

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本文編號：1850742