本文選題：多重耐藥 + 乙型肝炎病毒�。� 參考：《桂林醫(yī)學院》2017年碩士論文

【摘要】：目的:慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界性的公共健康威脅,HBV感染可以導致慢性乙型肝炎甚至可以引起肝硬化和肝細胞癌。HBV主要分為A-J十種不同的基因型,中國北方以C基因型HBV感染流行為主。目前主要的治療策略為干擾素治療和核苷(酸)類似物(NAs)抗病毒治療,近年來臨床上耐核苷類藥物和核苷酸類藥物的多重耐藥(multidrug-resistant,MDR)HBV感染呈逐年增多趨勢,給臨床治療帶來更大的挑戰(zhàn)。HBV穩(wěn)定復制動物模型是研究病毒特性和評價抗HBV藥物效果的重要工具,本研究目的是建立中國流行的C基因型野生型及多重耐藥型HBV穩(wěn)定復制小鼠模型并應用于NAs評價。方法:(1)分別構建攜帶1.3拷貝C基因野生(WT)和MDR HBV基因組(adr血清型)的重組腺相關病毒質粒p AAV2neo-1.3HBV-C-WT和p AAV2neo-1.3HBV-C-MDR。酶切和測序鑒定正確后分別體外轉染人肝癌細胞Huh7,用實時熒光定量PCR法檢測上清病毒水平,用ELISA方法檢測抗原水平。確認無誤后將病毒進行包裝純化。(2)將高滴度r AAV8-1.3HBV-C-WT病毒經尾靜脈注射入6-8周齡C57BL/6小鼠體內,建立野生HBV穩(wěn)定復制小鼠模型26只。小鼠體內病毒穩(wěn)定復制表達5周后,隨機抽取兩只小鼠取肝組織進行HE染色和免疫組化分析。將剩余小鼠隨機分成4組(n=6)不同給藥組,分別為恩替卡韋組(ETV,0.1mg/kg)、替諾福韋酯組(TDF,62mg/kg)、ETV(0.1mg/kg)+TDF(62mg/kg)組和生理鹽水(NS)對照組,連續(xù)給藥2周之后停藥觀察5周。動態(tài)監(jiān)測其血清(眼底靜脈叢采血)HBV DNA載量和HBs Ag、HBe Ag的抗原表達量。(3)用上述方法建立多重耐藥型HBV穩(wěn)定復制小鼠模型30只,同時以野生小鼠模型30只作為對照組,小鼠體內病毒穩(wěn)定復制表達6周后,將野生組和多重耐藥組兩組模型小鼠隨機分成5組(n=6)不同給藥組,分別為ETV組(0.1mg/kg)、TDF組(62mg/kg)、ETV(0.1mg/kg)+阿德福韋酯組(ADV,2.1mg/kg)、ETV(0.1mg/kg)+TDF(62mg/kg)組和NS對照組,給藥2周后停藥監(jiān)測8周。動態(tài)監(jiān)測其血清(眼底靜脈叢采血)HBV DNA載量和HBs Ag、HBe Ag的抗原表達量。結果:(1)重組質粒p AAV2neo-1.3HBV-C-WT和p AAV2neo-1.3HBV-C-MDR轉染Hu H7細胞72h后上清中HBV DNA載量均值分別為8.71 lg IU/ml和8.74 lg IU/ml;HBs Ag OD(A450nm)均值分別為3.50和3.38;HBe Ag OD(A450nm)均值分別為3.41和3.33。表明重組質粒構建正確并可在Huh7細胞中高水平復制和表達。(2)小鼠尾靜脈注射r AAV8-1.3HBV-C-WT后,建模觀察5周,HBV DNA定量維持在3.90~4.54 lg IU/ml,HBs Ag和HBe Ag OD(A450nm)維持在2以上,提示建模成功。給藥1周后檢測結果顯示,三個給藥組(ETV組、TDF組、ETV+TDF組)HBV DNA定量分別下降了1.84、2.23和2.08 lg IU/ml,與給藥前一周相比HBV DNA下降具有統(tǒng)計學意義(P0.05);NS組小鼠HBV DNA定量與給藥前持平。各給藥組在停藥1~2周后HBV DNA復制均出現反彈(1.0 lg IU/ml)。HBV-WT復制小鼠模型在造模、用藥以及停藥觀察期間,抗原檢測OD(A450nm)均有大于2的高表達。(3)HBV-C-MDR復制小鼠模型觀察6周過程中血清HBV DNA穩(wěn)定復制為3.14~5.49 lg IU/ml,HBs Ag OD(A450nm)維持在1.21~4.00,HBe Ag維持在1.67~4.00;NAs藥物用藥2周后,各用藥組(ETV、TDF、ETV+ADV、ETV+TDF)HBV DNA定量下降0.91,0.90,0.88,0.93 lg IU/ml(P0.05),但預想不到的是NS組HBV DNA也檢測到2.00 lg IU/ml的明顯下降(P0.05)。停藥后觀察8周,各組病毒復制均有波動。陽性對照HBV-C-WT復制小鼠模型組,造模觀察6周過程中血清HBV DNA定量穩(wěn)定為3.65~6.05 lg IU/ml;NAs藥物用藥2周后,各用藥組(ETV、TDF、ETV+ADV、ETV+TDF)HBV DNA定量下降3.66、3.48、3.18、2.89 lg IU/ml(P0.05),NS組無明顯下降(P0.05);各給藥組在停藥1~2周后HBV DNA復制均出現反彈(2 lg IU/ml)。HBV-C-WT復制小鼠模型在造模、用藥以及停藥觀察期間,抗原檢測均大于2的高表達。結論:本研究成功構建了p AAV2neo-1.3HBV-C-WT和p AAV2neo-1.3HBV-C-MDR重組質粒。并成功建立了重組腺相關病毒介導的C基因野生型HBV穩(wěn)定復制表達小鼠模型,初步驗證了NAs在上述模型小鼠體內可有效抑制野生病毒復制。本實驗亦對多重耐藥HBV復制小鼠模型的建立進行了探索,但與預期目標尚有一定差距,尚待進一步研究完善。以上小鼠模型的建立為進一步篩選新型有效抗中國流行株C基因型HBV藥物和治療方法提供了研究工具。
[Abstract]:Objective : Hepatitis B virus ( HBV ) infection is a worldwide public health threat . HBV infection can lead to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma . HBV - C - WT and pAAV2neo - 1.3HBV - C - MDR are detected . Results : ( 1 ) The mean values of HBV DNA were 3.41 and 3.38 , respectively , and the mean values of HBV DNA were 3.41 g IU / ml and 8.74 lg IU / ml , respectively . The results showed that : ( 1 ) The HBV DNA content of the recombinant plasmid pAAV2neo - 1.3HBV - C - WT and pAAV2neo - 1.3HBV - C - MDR decreased by 1 . 84 , 2 . 23 and 2 . 08 lg IU / ml , respectively . ( 3 ) HBV - C - WT replication in mice was 3.14 - 5.49 lg IU / ml , HBsAg OD ( A450 nm ) decreased by 3.65 - 6.05 lg IU / ml ( P0.05 ) . After two weeks of drug administration , the HBV DNA of each group ( ETV , TDF , ETV + ADV, ETV + TDF ) decreased 3.66 , 3.48 , 3.18 , 2.89 lg IU / ml ( P0.05 ) . Conclusion : This study successfully constructed the recombinant plasmid pAAV2neo - 1.3HBV - C - WT and pAAV2neo - 1.3HBV - C - MDR .

【學位授予單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R512.62;R-332

【參考文獻】

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本文編號：1846906