本文選題：多重耐藥 + 乙型肝炎病毒��； 參考：《桂林醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：目的:慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界性的公共健康威脅,HBV感染可以導(dǎo)致慢性乙型肝炎甚至可以引起肝硬化和肝細(xì)胞癌。HBV主要分為A-J十種不同的基因型,中國(guó)北方以C基因型HBV感染流行為主。目前主要的治療策略為干擾素治療和核苷(酸)類(lèi)似物(NAs)抗病毒治療,近年來(lái)臨床上耐核苷類(lèi)藥物和核苷酸類(lèi)藥物的多重耐藥(multidrug-resistant,MDR)HBV感染呈逐年增多趨勢(shì),給臨床治療帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)。HBV穩(wěn)定復(fù)制動(dòng)物模型是研究病毒特性和評(píng)價(jià)抗HBV藥物效果的重要工具,本研究目的是建立中國(guó)流行的C基因型野生型及多重耐藥型HBV穩(wěn)定復(fù)制小鼠模型并應(yīng)用于NAs評(píng)價(jià)。方法:(1)分別構(gòu)建攜帶1.3拷貝C基因野生(WT)和MDR HBV基因組(adr血清型)的重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒p AAV2neo-1.3HBV-C-WT和p AAV2neo-1.3HBV-C-MDR。酶切和測(cè)序鑒定正確后分別體外轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞Huh7,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)上清病毒水平,用ELISA方法檢測(cè)抗原水平。確認(rèn)無(wú)誤后將病毒進(jìn)行包裝純化。(2)將高滴度r AAV8-1.3HBV-C-WT病毒經(jīng)尾靜脈注射入6-8周齡C57BL/6小鼠體內(nèi),建立野生HBV穩(wěn)定復(fù)制小鼠模型26只。小鼠體內(nèi)病毒穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)5周后,隨機(jī)抽取兩只小鼠取肝組織進(jìn)行HE染色和免疫組化分析。將剩余小鼠隨機(jī)分成4組(n=6)不同給藥組,分別為恩替卡韋組(ETV,0.1mg/kg)、替諾福韋酯組(TDF,62mg/kg)、ETV(0.1mg/kg)+TDF(62mg/kg)組和生理鹽水(NS)對(duì)照組,連續(xù)給藥2周之后停藥觀察5周。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其血清(眼底靜脈叢采血)HBV DNA載量和HBs Ag、HBe Ag的抗原表達(dá)量。(3)用上述方法建立多重耐藥型HBV穩(wěn)定復(fù)制小鼠模型30只,同時(shí)以野生小鼠模型30只作為對(duì)照組,小鼠體內(nèi)病毒穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)6周后,將野生組和多重耐藥組兩組模型小鼠隨機(jī)分成5組(n=6)不同給藥組,分別為ETV組(0.1mg/kg)、TDF組(62mg/kg)、ETV(0.1mg/kg)+阿德福韋酯組(ADV,2.1mg/kg)、ETV(0.1mg/kg)+TDF(62mg/kg)組和NS對(duì)照組,給藥2周后停藥監(jiān)測(cè)8周。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其血清(眼底靜脈叢采血)HBV DNA載量和HBs Ag、HBe Ag的抗原表達(dá)量。結(jié)果:(1)重組質(zhì)粒p AAV2neo-1.3HBV-C-WT和p AAV2neo-1.3HBV-C-MDR轉(zhuǎn)染Hu H7細(xì)胞72h后上清中HBV DNA載量均值分別為8.71 lg IU/ml和8.74 lg IU/ml;HBs Ag OD(A450nm)均值分別為3.50和3.38;HBe Ag OD(A450nm)均值分別為3.41和3.33。表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確并可在Huh7細(xì)胞中高水平復(fù)制和表達(dá)。(2)小鼠尾靜脈注射r AAV8-1.3HBV-C-WT后,建模觀察5周,HBV DNA定量維持在3.90~4.54 lg IU/ml,HBs Ag和HBe Ag OD(A450nm)維持在2以上,提示建模成功。給藥1周后檢測(cè)結(jié)果顯示,三個(gè)給藥組(ETV組、TDF組、ETV+TDF組)HBV DNA定量分別下降了1.84、2.23和2.08 lg IU/ml,與給藥前一周相比HBV DNA下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);NS組小鼠HBV DNA定量與給藥前持平。各給藥組在停藥1~2周后HBV DNA復(fù)制均出現(xiàn)反彈(1.0 lg IU/ml)。HBV-WT復(fù)制小鼠模型在造模、用藥以及停藥觀察期間,抗原檢測(cè)OD(A450nm)均有大于2的高表達(dá)。(3)HBV-C-MDR復(fù)制小鼠模型觀察6周過(guò)程中血清HBV DNA穩(wěn)定復(fù)制為3.14~5.49 lg IU/ml,HBs Ag OD(A450nm)維持在1.21~4.00,HBe Ag維持在1.67~4.00;NAs藥物用藥2周后,各用藥組(ETV、TDF、ETV+ADV、ETV+TDF)HBV DNA定量下降0.91,0.90,0.88,0.93 lg IU/ml(P0.05),但預(yù)想不到的是NS組HBV DNA也檢測(cè)到2.00 lg IU/ml的明顯下降(P0.05)。停藥后觀察8周,各組病毒復(fù)制均有波動(dòng)。陽(yáng)性對(duì)照HBV-C-WT復(fù)制小鼠模型組,造模觀察6周過(guò)程中血清HBV DNA定量穩(wěn)定為3.65~6.05 lg IU/ml;NAs藥物用藥2周后,各用藥組(ETV、TDF、ETV+ADV、ETV+TDF)HBV DNA定量下降3.66、3.48、3.18、2.89 lg IU/ml(P0.05),NS組無(wú)明顯下降(P0.05);各給藥組在停藥1~2周后HBV DNA復(fù)制均出現(xiàn)反彈(2 lg IU/ml)。HBV-C-WT復(fù)制小鼠模型在造模、用藥以及停藥觀察期間,抗原檢測(cè)均大于2的高表達(dá)。結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了p AAV2neo-1.3HBV-C-WT和p AAV2neo-1.3HBV-C-MDR重組質(zhì)粒。并成功建立了重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的C基因野生型HBV穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)小鼠模型,初步驗(yàn)證了NAs在上述模型小鼠體內(nèi)可有效抑制野生病毒復(fù)制。本實(shí)驗(yàn)亦對(duì)多重耐藥HBV復(fù)制小鼠模型的建立進(jìn)行了探索,但與預(yù)期目標(biāo)尚有一定差距,尚待進(jìn)一步研究完善。以上小鼠模型的建立為進(jìn)一步篩選新型有效抗中國(guó)流行株C基因型HBV藥物和治療方法提供了研究工具。
[Abstract]:Objective : Hepatitis B virus ( HBV ) infection is a worldwide public health threat . HBV infection can lead to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma . HBV - C - WT and pAAV2neo - 1.3HBV - C - MDR are detected . Results : ( 1 ) The mean values of HBV DNA were 3.41 and 3.38 , respectively , and the mean values of HBV DNA were 3.41 g IU / ml and 8.74 lg IU / ml , respectively . The results showed that : ( 1 ) The HBV DNA content of the recombinant plasmid pAAV2neo - 1.3HBV - C - WT and pAAV2neo - 1.3HBV - C - MDR decreased by 1 . 84 , 2 . 23 and 2 . 08 lg IU / ml , respectively . ( 3 ) HBV - C - WT replication in mice was 3.14 - 5.49 lg IU / ml , HBsAg OD ( A450 nm ) decreased by 3.65 - 6.05 lg IU / ml ( P0.05 ) . After two weeks of drug administration , the HBV DNA of each group ( ETV , TDF , ETV + ADV, ETV + TDF ) decreased 3.66 , 3.48 , 3.18 , 2.89 lg IU / ml ( P0.05 ) . Conclusion : This study successfully constructed the recombinant plasmid pAAV2neo - 1.3HBV - C - WT and pAAV2neo - 1.3HBV - C - MDR .

【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1846906