本文選題：強直性脊柱炎 + 內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)氨基肽酶�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學》2016年碩士論文

【摘要】：強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種常見的系統(tǒng)性自身免疫性關節(jié)炎,與銀屑病關節(jié)炎、炎性腸病性關節(jié)炎、反應性關節(jié)炎等同屬于血清陰性脊柱關節(jié)病(seronegative spondyloarthritis,SpA),有共同的疾病特點。AS好發(fā)于青壯年男性,起病隱匿,雖然診斷方法和手段的改進提高了早期診斷率,但還是有很多患者由于延誤診斷和治療而導致關節(jié)功能喪失、殘疾,嚴重影響患者的生活質量,造成其家庭和社會的沉重的經(jīng)濟負擔。AS是一種慢性炎癥性關節(jié)炎,以脊柱和骶髂關節(jié)為著,表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、晨僵,并導致關節(jié)融合和脊柱強直。因此,炎癥是疾病發(fā)病機制中的重要因素,但對其發(fā)生的原因和過程的認知有限。目前尚無方法治愈AS,現(xiàn)有的治療措施只能緩解疼痛、抑制炎癥發(fā)展的進程,且只對部分病人有效。目的:強直性脊柱炎發(fā)病機制不明。40余年前發(fā)現(xiàn)其與HLA-B27強相關,但其在AS發(fā)病機制中的作用尚不清楚。全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association studies,GWAS)的發(fā)展發(fā)掘出越來越多與AS相關的基因位點。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)氨基肽酶(endoplasmic reticulum resident aminopeptidases,ERAP)也與疾病顯著相關,且與HLA-B27存在基因間的相互作用。兩者均位于內(nèi)源性抗原遞呈途徑中,功能上也存在交互作用。本研究擬建立該交互作用的體外研究體系。方法:HLA-B27中與AS相關且常見的亞型為HLA-B27:04(漢族人群)和B27:05(高加索人種)。選擇HLA-B27:04/B27:05+的AS患者和健康對照,用EBV將其B細胞轉化為B淋巴母細胞(B lymphoblastoid cell line,B-LCL)。為將自然存在的ERAP基因變異與其抗原肽段的剪切功能相聯(lián)系,將mRNA逆轉錄成cDNA后進行Sanger測序。通過CRISPR/Cas9技術分別或同時敲除這ERAP1和ERAP2基因,以下一步將野生型和測序獲得的變異基因序列轉染至上述細胞,比較其對HLA-B27限制性的自然抗原肽剪切功能的不同。為盡量體現(xiàn)其剪切功能的差異,需建立多種不同特異性的T細胞,其中包括HLA-B27:04/B27:05限制性異體特異性T細胞,故克隆HLA-B27:04/B27:05分子,建立C1R-B27:04/B27:05細胞系,予以刺激上述T細胞。結果:我們成功地將健康對照和AS患者來源的B細胞轉化為B-LCL,用CRISPR/Cas9技術敲除了B-LCL的ERAP2基因。測序患者和對照外周血樣本mRNA獲得自然存在的ERAP1和ERAP2基因序列,ERAP1的5個AS相關單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)的組成在患者和對照樣本中未見明顯差異,但ERAP2在AS患者中的變異較明顯,且可能存在新的可變剪切。我們從患者B-LCL中克隆了HLA-B27:04基因,以建立C1R-B27:04細胞系,用于刺激HLA-B27:04限制性異體抗原特異性的T細胞。結論:本研究建立ERAP變異基因功能的體外研究體系的方法可行,待下一步建立HLA-B27:04/B27:05限制性的肽段特異性的T細胞,即可比較ERAP1基因變異所導致的肽段剪切功能變化,并可進一步按原計劃敲除ERAP1基因。
[Abstract]:Ankylosing spondylitis (AS) is a common systemic autoimmune arthritis. It is associated with psoriatic arthritis, inflammatory enteritis, and reactive arthritis (reactive arthritis) as seronegative spinal arthropathy (seronegative spondyloarthritis, SpA). There is a common disease characteristic of.AS in young and young men, and the onset of disease is hidden. Although the improvement of diagnostic methods and methods improves the early diagnosis rate, there are still many patients with loss of joint function due to delayed diagnosis and treatment, which seriously affect the quality of life of the patients, and cause the heavy economic burden of their family and society.AS is a chronic inflammatory arthritis, with the spinal and sacroiliac joint as a kind of arthritis. As a result of joint pain, morning stiffness, joint fusion and spinal rigidity, inflammation is an important factor in the pathogenesis of the disease, but the causes and processes of the disease are limited. At present, there is no cure for AS. The existing treatment measures can only relieve pain, inhibit the progress of inflammation, and only be effective for some patients. The pathogenesis unknown.40 of ankylosing spondylitis has been found to be strongly associated with HLA-B27, but its role in the pathogenesis of AS is not clear. The development of genome-wide association studies (GWAS) has discovered more and more gene sites associated with AS. The study found that the endoplasmic reticulum aminopeptidase (endoplasmic re) is found. Ticulum resident aminopeptidases, ERAP) is also significantly associated with the disease, and the interaction between genes and HLA-B27. Both are located in the endogenous antigen presentation pathway, and there are interaction functions. This study intends to establish an in vitro research system for this interaction. Method: the common subtype of AS in HLA-B27 is HLA-B27:04 (HLA-B27:04). The Han population and the B27:05 (Caucasus). Select the AS patients and healthy controls of HLA-B27:04/B27:05+ and convert their B cells into B lymphoblastic cells (B lymphoblastoid cell line, B-LCL) with EBV. After CRISPR/Cas9, the ERAP1 and ERAP2 genes are knocked out, respectively. The following step is to transfect the mutant gene sequences of wild type and sequencing to the above cells to compare the different shear function of the natural antigen peptide to the HLA-B27 restriction. In order to reflect the difference of its shear function, a variety of different specific T cells need to be established. HLA-B27:04/B27:05 restrictive allogeneic T cells, therefore, clone HLA-B27:04/B27:05 molecules and establish C1R-B27:04/B27:05 cell lines to stimulate the T cells. Results: we successfully transformed healthy controls and B cells from AS patients to B-LCL, and the ERAP2 gene of B-LCL was knocked out with CRISPR/Cas9 technology. The peripheral blood sample mRNA obtained the natural ERAP1 and ERAP2 gene sequences, and the composition of the 5 AS related single nucleotide polymorphisms (single nucleotide polymorphism, SNP) of ERAP1 was not significantly different in the patient and the control sample, but the ERAP2 in the AS patient was more obvious, and there might be a new variable shear. We were from the patient B-LCL. The HLA-B27:04 gene was augmentation to establish the C1R-B27:04 cell line to stimulate the HLA-B27:04 restrictive alloantigen specific T cells. Conclusion: This study is feasible to establish an in vitro study system for the function of ERAP variant gene. The next step of establishing a HLA-B27:04/B27:05 restrictive peptide specific T cell can be used to compare the variation of ERAP1 gene. The changes of peptide shear function can be induced and the ERAP1 gene can be knocked out according to the original plan.

【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R593.23

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