本文選題：擬穴青蟹 + 蛻皮周期��； 參考：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：蛻皮是甲殼動物生長發(fā)育中重要的生物學(xué)現(xiàn)象。蛻皮周期中的離子轉(zhuǎn)運對甲殼動物生長、存活和繁殖都具有重要的生理學(xué)意義。然而目前關(guān)于甲殼動物蛻皮周期中離子轉(zhuǎn)運的分子機制仍然不明確。本文以擬穴青蟹為研究對象,依據(jù)第三顎足上剛毛的形態(tài)變化,將擬穴青蟹蛻皮周期準確劃分為蛻皮后期、蛻皮間期、蛻皮前期和蛻皮期。通過電鏡、HE染色等方法,分析了擬穴青蟹離子轉(zhuǎn)運的主要器官——鰓的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特征。通過分子生物學(xué)方法,發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹肝胰腺中,鈣網(wǎng)蛋白(CRT)在蛻殼周期中的基因表達量變化與鈣含量的變化趨勢具有相似性,說明鈣網(wǎng)蛋白可能參與肝胰腺中鈣離子的存儲過程;同時發(fā)現(xiàn),擬穴青蟹血淋巴中的Na+、Cl-濃度以及滲透壓變化規(guī)律與Na+/K+/2Cl-共轉(zhuǎn)運蛋白(NKCC)的基因表達量變化一致,說明它可能參與蛻皮后期滲透壓調(diào)節(jié)中的離子吸收過程。該研究為深入解析甲殼動物蛻皮周期中離子轉(zhuǎn)運的相關(guān)機制打下了良好基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:1.擬穴青蟹蛻皮周期的劃分采用擬穴青蟹第三顎足的剛毛發(fā)育和游泳足內(nèi)皮發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征對其蛻皮周期的劃分進行了研究。結(jié)果顯示,采用第三顎足可以將蛻皮周期劃分為:蛻皮后期A期、B期;蛻皮間期為C期;蛻皮前期被細分為D0亞期、D1亞期、D2亞期;蛻皮期E期。采用游泳足也可以將其劃分為幾個類似的蛻皮時期。但是由于擬穴青蟹游泳足較厚,透明度較差,不能精確地對蛻皮周期進行劃分。因此,采用第三顎足的剛毛發(fā)育的分期方法更加清晰、精確。2.擬穴青蟹鰓的結(jié)構(gòu)結(jié)合運用掃描電鏡,透射電鏡以及HE染色技術(shù),對擬穴青蟹的離子轉(zhuǎn)運的器官-鰓的結(jié)構(gòu)進行了形態(tài)學(xué)分析。結(jié)果表明,擬穴青蟹具有8對鰓,每條鰓由中心鰓軸及其向兩側(cè)的層片狀鰓葉組成,鰓葉之間具有囊狀結(jié)構(gòu),可能起到支撐和控制鰓間距的功能。鰓壁外被角質(zhì)層,內(nèi)由上皮細胞、隔膜和中央血腔構(gòu)成。切片結(jié)果顯示:前鰓中,上皮細胞主要以薄細胞為主,中央血腔相對較大,細胞內(nèi)線粒體和膜結(jié)構(gòu)相對較少,為鰓的呼吸型上皮;而后鰓中厚細胞居多,細胞內(nèi)含有豐富的膜結(jié)構(gòu)和線粒體,從而分別為離子轉(zhuǎn)運提供酶的著位點和能量,因而更有利于離子的主動轉(zhuǎn)運和物質(zhì)的吸收,為離子型上皮。因此,擬穴青蟹的前鰓主要參與呼吸作用,而后鰓則在離子轉(zhuǎn)運中具有重要的作用。3.外殼在擬穴青蟹蛻皮過程中的礦化過程應(yīng)用掃描電鏡對擬穴青蟹不同蛻皮時期(A期、C期、D期、E期)的外殼截面進行掃描。結(jié)果顯示:擬穴青蟹外殼在蛻皮后期A具有上表皮、外表皮和內(nèi)表皮。進入蛻皮間期C,表皮最內(nèi)層的膜層形成,具備完整的表皮結(jié)構(gòu),厚度增加。到了蛻皮前期,表皮厚度繼續(xù)增加,膜層消失。蛻皮期丟棄的外殼,厚度和蛻皮前期相近,但上皮層消失。在外殼中主要含有C(40.91%)、O(36.59%)、Ca(12.58%)、P(7.60%)幾種元素,其他還含有少量的Si、P、S、Mg、Na等元素。說明了擬穴青蟹的外殼中可能主要以碳酸鈣和磷酸鈣鹽為主。在不同的蛻皮時期內(nèi),鈣的相對含量發(fā)生周期性變化,蛻皮后期,外殼鈣濃度最低(0.42%);蛻皮間期完成礦化后,鈣濃度上升到13.94%;蛻皮前期,外殼中鈣濃度達到21.35%;蛻皮期達到最大值為29.75%。證明了擬穴青蟹外殼的鈣離子隨著蛻皮周期而逐漸累積,使得其外殼的厚度和機械強度增加。蛻皮時,擬穴青蟹丟失大部分鈣,隨后的礦化過程則需要迅速補充大量的鈣。4.鈣網(wǎng)蛋白在擬穴青蟹蛻皮周期中鈣代謝的調(diào)節(jié)作用應(yīng)用同源克隆策略和RACE技術(shù)從擬穴青蟹克隆了鈣網(wǎng)蛋白CRT基因,經(jīng)實時熒光定量PCR檢測,CRT基因在擬穴青蟹的肌肉、鰓、肝臟、觸角腺、胸神經(jīng)節(jié)、心臟、腸、上皮等8個組織中均表達,說明其參與擬穴青蟹多種生理功能的調(diào)節(jié),但表達量有顯著差異,其中在肝胰腺中表達量遠高于心臟和腸等組織。在不同的蛻皮周期內(nèi),原子吸收光譜和焦銻酸鉀沉淀法結(jié)果顯示:肝胰腺的鈣離子在蛻皮后迅速降低,蛻皮間期保持平衡,蛻皮前期存儲量增加,這和CRT mRNA在不同蛻皮時期的表達量具有一定的一致性。上述試驗結(jié)果表明,CRT基因可能參與肝胰腺中Ca2+的儲存過程。5.NKCC在擬穴青蟹蛻皮周期中滲透壓的調(diào)節(jié)功能應(yīng)用同源克隆策略和RACE技術(shù),從擬穴青蟹鰓中成功克隆得到Na+/K+/2Cl-共轉(zhuǎn)運蛋白(NKCC)基因。NKCC基因全長4151bp,編碼1053個氨基酸,組織分布的結(jié)果表明SpNKCC mRNA主要在鰓組織中集中表達,尤其是參與離子轉(zhuǎn)運的后鰓中表達量最高。在蛻皮周期中,血淋巴滲透壓,Na+、Cl-在蛻皮期最低,蛻皮后期(A-B)迅速增加,隨后間期達到平衡,在蛻皮前期又進一步升高。蛻皮SpNKCC mRNA在蛻皮后期的離子吸收的時期表達量迅速增加,同時和許多參與離子吸收的基因表達量一致,說明了后鰓的SpNKCC參與了蛻皮后期的離子平衡時的離子吸收。
[Abstract]:In this paper , it is found that the changes of the expression of Na + , Cl - and osmotic pressure in the ecdysis cycle are similar to that of Na + / K + / Cl - co - transporter ( NKCC ) . In the early stage of molting , the contents of calcium in the shell were changed periodically , the thickness of the outer skin and the outer skin were the lowest ( 0 . 42 % ) . The expression of NKCC mRNA in gill tissues was significantly higher than that of heart and intestine . The results showed that the expression of NKCC mRNA was significantly higher than that of heart and intestine .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：1834619