本文選題：PLK1 + 淋巴瘤�。� 參考：《南華大學》2016年碩士論文

【摘要】：[目的]Polo樣激酶1(polo-like kinase 1,PLK1)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,在調(diào)節(jié)細胞周期、維持基因組穩(wěn)定和修復DNA損傷中起重要作用。研究表明PLK1在人類多數(shù)腫瘤中高表達,我們前期實驗也發(fā)現(xiàn)EBV轉(zhuǎn)化淋巴母細胞中PLK1表達上調(diào)。本實驗通過體外細胞實驗及動物實驗,觀察RNA干擾PLK1表達對淋巴瘤Raji細胞增殖、遷移侵襲、細胞周期和凋亡以及裸鼠移植瘤形成等生物學行為的影響,研究PLK1在EBV相關(guān)淋巴瘤發(fā)生中的作用,為淋巴瘤的分子機制研究與靶向治療提供實驗依據(jù)。[方法]構(gòu)建針對PLK1基因的慢病毒干擾載體p Len R-GPHh PLK1-sh,建立PLK1穩(wěn)定低表達的Raji細胞系,倒置熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)綠色熒光情況,經(jīng)過q RT-PCR及Western Blot技術(shù)驗證PLK1干擾效果。采用CCK-8、流式細胞術(shù)、遷移侵襲實驗及裸鼠成瘤實驗,觀察PLK1表達改變前后淋巴瘤Raji細胞生物學行為的變化。[結(jié)果]1.成功建立PLK1穩(wěn)定低表達的Raji細胞系。重組質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果與預期相符,質(zhì)粒測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對顯示,目的基因的干擾質(zhì)粒p Len R-GPH-h PLK1-sh與設(shè)計的干擾序列吻合率達100%,證明載體構(gòu)建成功;熒光顯微鏡觀察顯示轉(zhuǎn)染組攜帶綠色熒光的細胞數(shù)達80%;q RT-PCR、Western Blot檢測表明轉(zhuǎn)染p Len R-GPH-h PLK1-sh質(zhì)粒的細胞(干擾組,Raji/PLK1 sh RNA)較轉(zhuǎn)染p Len R-GPH的細胞(空載體組,Raji/GPH)和普通Raji細胞(空白組)相比,PLK1基因的m RNA表達及蛋白水平均明顯降低,表明成功建立PLK1穩(wěn)定低表達的Raji細胞系。且干擾組PLK1-SH1中PLK1 m RNA水平下降更為明顯,提示干擾效果最好,所以選取PLK1-SH1組進入后續(xù)實驗。2.干擾PLK1表達可抑制淋巴瘤Raji細胞的增殖、遷移侵襲能力,誘導G2期阻滯和凋亡,并抑制裸鼠移植瘤的形成。CCK-8結(jié)果顯示:干擾組較空載體組及空白組相比,生長速度慢,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),表明干擾PLK1表達可抑制Raji細胞的增殖。遷移侵襲實驗結(jié)果顯示:干擾組較空載體組及空白組相比,遷移細胞數(shù)較少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);干擾組穿過Matrigel基質(zhì)膠的細胞數(shù)明顯少于空載體組及空白組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),表明干擾PLK1的表達可抑制淋巴瘤Raji細胞的遷移和侵襲能力。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:干擾組較空載體組及空白組相比,G2期細胞百分比顯著升高,G1期細胞百分比降低(P0.01);細胞早期凋亡率明顯升高(P0.01),差異有統(tǒng)計學意義。表明干擾PLK1表達可誘導淋巴瘤Raji細胞G2期阻滯和凋亡。裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示:空載體組及空白組各組成瘤率達80%;而干擾組成瘤率為0%。干擾組相比于對照組,裸鼠成瘤率明顯下降,這提示干擾PLK1的表達,對裸鼠移植瘤的形成有顯著抑制作用。[結(jié)論]干擾PLK1的表達可抑制淋巴瘤Raji細胞增殖、遷移侵襲及移植瘤形成,誘導凋亡與周期阻滯。
[Abstract]:[objective] Polo like kinase (1(polo-like kinase 1) is a serine / threonine protein kinase, which plays an important role in regulating cell cycle, maintaining genomic stability and repairing DNA damage. Studies have shown that PLK1 is highly expressed in most human tumors, and we also found that the expression of PLK1 in transformed lymphoblastocytes of EBV was up-regulated in our previous experiments. The effects of RNA interfering PLK1 expression on the proliferation, migration, invasion, cell cycle and apoptosis of lymphoma Raji cells and the formation of xenografts in nude mice were observed by in vitro cell experiments and animal experiments. To study the role of PLK1 in the pathogenesis of EBV-associated lymphoma and to provide experimental evidence for the molecular mechanism and targeted therapy of lymphoma. [methods] the lentivirus interference vector p Len R-GPHh PLK1-shtargeted at PLK1 gene was constructed, and a stable and low expression Raji cell line with PLK1 was established. The green fluorescence was observed by inverted fluorescence microscope. The effect of PLK1 interference was verified by Q RT-PCR and Western Blot techniques. Using CCK-8, flow cytometry, migration and invasion assay and tumorigenesis in nude mice, the biological behavior of lymphoma Raji cells was observed before and after the change of PLK1 expression. [result] 1. Raji cell lines with stable and low expression of PLK1 were successfully established. The result of restriction endonuclease electrophoresis of the recombinant plasmid was consistent with the expected results. The result of plasmid sequencing showed that the interference plasmid p Len R-GPH-h PLK1-sh of the target gene coincided with the designed interference sequence by 100%, which proved that the vector was successfully constructed. Fluorescence microscopy showed that the number of cells carrying green fluorescence in the transfected group was 80% and that the cells transfected with p Len R-GPH-h PLK1-sh plasmid (interference group Raji / PLK1 sh) were higher than those transfected with p Len R-GPH (empty vector group) and ordinary Raji cells. Compared with the control group, the expression of m RNA and the protein level of PLK1 gene were significantly decreased. The results showed that Raji cell line with stable and low expression of PLK1 was successfully established. The decrease of PLK1 m RNA level in PLK1-SH1 was more obvious in the interference group, indicating that the interference effect was the best, so the PLK1-SH1 group was selected to enter the follow-up experiment. 2. Interfering the expression of PLK1 could inhibit the proliferation, migration and invasion of Raji cells, induce G2 phase arrest and apoptosis, and inhibit the formation of xenografts in nude mice. The results showed that the growth rate of interference group was slower than that of empty vector group and blank group. The difference was statistically significant (P 0.01), indicating that interfering with PLK1 expression could inhibit the proliferation of Raji cells. The results of migration and invasion experiments showed that the number of migration cells in the interference group was less than that in the empty carrier group and the blank group, the difference was statistically significant (P 0.05), and the number of cells passing through the Matrigel matrix in the interference group was significantly less than that in the empty carrier group and blank group. The difference was statistically significant (P 0.01), suggesting that interfering with the expression of PLK1 could inhibit the migration and invasion of lymphoma Raji cells. The results of flow cytometry showed that the percentage of cells in G _ 2 phase in the interference group was significantly higher than that in the empty carrier group and the blank group, and the percentage of cells in the G _ 1 phase was lower than that in the control group, and the apoptosis rate in the early stage was significantly higher than that in the control group (P _ (0.01). It was suggested that interfering with PLK1 expression could induce G 2 arrest and apoptosis in lymphoma Raji cells. The results of nude mice tumorigenesis test showed that the tumor rate of empty carrier group and blank group was 80%, while that of interference group was 0%. Compared with the control group, the tumorigenesis rate in the interference group was significantly lower than that in the control group, which suggested that interfering with the expression of PLK1 could significantly inhibit the formation of xenografts in nude mice. [conclusion] interfering with the expression of PLK1 can inhibit the proliferation, migration and invasion of Raji cells, induce apoptosis and cell cycle arrest.
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.1

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本文編號：1830783