本文選題：半滑舌鰨 + 顯微注射技術(shù)��； 參考：《上海海洋大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：一、半滑舌鰨基因組編輯TALEN技術(shù)的建立基因組編輯技術(shù)對(duì)于海洋動(dòng)物基因功能分析和基因工程育種具有重大意義和應(yīng)用價(jià)值,開(kāi)展海水養(yǎng)殖動(dòng)物基因組編輯技術(shù)的研究,對(duì)于培育定點(diǎn)突變的海水養(yǎng)殖動(dòng)物新品種至關(guān)重要。但由于海水養(yǎng)殖魚(yú)類胚胎顯微注射技術(shù)難度大,至今少有成功的報(bào)道,加之海水魚(yú)類仔魚(yú)數(shù)量過(guò)少、難以培育成活等問(wèn)題,嚴(yán)重阻礙了海水魚(yú)類基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)程,迄今國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有關(guān)海水養(yǎng)殖魚(yú)類基因組編輯的成功報(bào)道。本研究成功建立了海水鲆鰈魚(yú)類半滑舌鰨胚胎顯微注射技術(shù)及基因組編輯技術(shù),并在性別決定基因功能驗(yàn)證上取得突破性進(jìn)展。將GFP質(zhì)粒成功顯微注射到半滑舌鰨胚胎中并表達(dá);利用TALEN技術(shù)成功敲除了半滑舌鰨Z染色體上的dmrt1基因,并獲得了33尾基因突變魚(yú)。二、半滑舌鰨dmrt1基因在性別決定及性腺發(fā)育過(guò)程中的功能本研究通過(guò)靶向dmrt1基因的TALEN m RNA顯微注射到半滑舌鰨胚胎中,成功誘導(dǎo)dmrt1基因的突變,突變效率最高達(dá)100%。ZZ型dmrt1突變魚(yú)發(fā)育成中間有一個(gè)腔的卵巢樣精巢,精子發(fā)生被阻斷。Dmrt1突變雄魚(yú)的性腺中雌性性別相關(guān)基因foxl2和cyp19a1a顯著性增加。Dmrt1突變雄魚(yú)比正常雄魚(yú)生長(zhǎng)快,與正常雌魚(yú)長(zhǎng)勢(shì)一樣。同時(shí),檢測(cè)到1尾雌雄同體魚(yú),該魚(yú)的遺傳性別為ZW型,其上側(cè)性腺外形上像精巢,下側(cè)性腺外形上像卵巢。上下側(cè)性腺切片染色結(jié)果顯示,上側(cè)性腺呈現(xiàn)典型的精巢結(jié)構(gòu),而下側(cè)性腺則呈現(xiàn)卵巢樣結(jié)構(gòu)。采用PCR分析了雌雄同體魚(yú)性腺的dmrt1基因突變情況,在上側(cè)的精巢中未檢測(cè)到的dmrt1基因的突變,而在下側(cè)的卵巢樣性腺中則檢測(cè)到dmrt1基因的許多突變。由此表明dmrt1基因是半滑舌鰨雄性精巢發(fā)育必不可少的基因,是半滑舌鰨的雄性決定基因,并且是關(guān)聯(lián)著生長(zhǎng)二態(tài)性。三、半滑舌鰨雄性性別決定基因dmrt1突變家系的建立通過(guò)基因組編輯技術(shù)敲除了半滑舌鰨dmrt1基因,將dmrt1基因定點(diǎn)突變魚(yú)培育至性成熟。然后分別在2015年和2016年通過(guò)人工繁育技術(shù)將篩選出的dmrt1基因定點(diǎn)突變的F0代ZZ雄魚(yú)與野生型雌魚(yú)、突變的F0代ZW雌魚(yú)與野生型雄魚(yú)、突變的F0代雌魚(yú)與雄魚(yú)分別進(jìn)行雜交得到雜交子代魚(yú),并進(jìn)行了子代魚(yú)苗的dmrt1基因的檢測(cè)。結(jié)果證明,父母本的dmrt1突變基因遺傳到了子代魚(yú)中。未來(lái)還需要做進(jìn)一步的人工選育工作,并最終獲得生長(zhǎng)快的家系。
[Abstract]:Establishment of Genome Editing TALEN technique for Cynoglossus semilaevis Genome Editing technique has great significance and application value for gene function analysis and genetic engineering breeding of marine animals. It is very important to cultivate new species of mariculture animals with site-directed mutagenesis. However, due to the difficulty of microinjection of marine fish embryos, there are few successful reports so far, in addition to the small number of marine fish larvae, it is difficult to grow and survive, which seriously hinders the research process of marine fish genome editing technology. So far, there has been no successful report on genome editing of mariculture fish at home and abroad. In this study, the embryo microinjection and genome editing techniques of sole sole were successfully established, and a breakthrough was made in the functional verification of sex-determining genes. The GFP plasmid was microinjected into the embryo of Cynoglossus semilaevis and the dmrt1 gene on Z chromosome of Cynoglossus semilaevis was successfully knocked out by TALEN technique and 33 mutant fish were obtained. Second, the function of dmrt1 gene in sex determination and gonadal development of Cynoglossus semilaevis. The aim of this study was to induce the mutation of dmrt1 gene by microinjection of TALEN m RNA targeting dmrt1 gene into the embryo of Cynoglossus semilaevis. The mutational efficiency of 100%.ZZ type dmrt1 mutant fish developed into an ovary like nest with a middle cavity. The sex-related genes foxl2 and cyp19a1a in the gonad of the male with blocked spermatogenesis. Dmrt1 mutated male grew faster than the normal male, and the female sex related genes foxl2 and cyp19a1a increased significantly in the gonadal gland of the male. It's the same as the normal female. At the same time, a hermaphrodite fish was detected. Its genetic character was ZW type. The shape of the upper gonad was similar to that of the testis, and the shape of the lower gonad looked like the ovary. The results of upper and lower gonad sections showed that the upper gonad presented a typical spermary structure, while the lower gonad presented an ovarian like structure. PCR was used to analyze the mutation of dmrt1 gene in the gonad of the hermaphrodite fish. The mutation of dmrt1 gene was not detected in the upper testis, but many mutations of the dmrt1 gene were detected in the ovary like gland on the lower side. It is concluded that dmrt1 gene is essential for the development of male spermatozoa of Cynoglossus semilaevis and is the male determinant gene of Cynoglossus semilaevis and is related to growth dimorphism. Third, the establishment of the dmrt1 mutation family of male sex determinant gene of Cynoglossus semilaevis by genomic editing technique, the dmrt1 gene of Cynoglossus semilaevis was knocked out, and the dmrt1 gene site-directed mutant fish was bred to sexual maturity. The selected F0 generation ZZ male and wild female, the mutant F0 generation ZW female and the wild male were selected by artificial breeding in 2015 and 2016, respectively. The F _ 0 generation female and male fish were hybridized to obtain the hybrid offspring, and the dmrt1 gene of the offspring was detected. The results showed that the parent's dmrt1 mutation gene was inherited into the offspring of fish. In the future, further artificial breeding is needed, and fast growing families will eventually be obtained.
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

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