本文選題：Pim- + 腺相關(guān)病毒載體　； 參考：《解剖學(xué)報》2017年02期

【摘要】：目的構(gòu)建攜帶大鼠原癌基因Pim-1的重組腺相關(guān)病毒2載體(rAAV2-Pim-1),檢測其體內(nèi)感染大鼠視網(wǎng)膜的細(xì)胞類型及目的基因Pim-1在視網(wǎng)膜中的表達(dá)。方法 p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-MCS-3FLAG載體及Pim-1基因PCR產(chǎn)物用Nhel酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收載體及目的基因DNA并連接轉(zhuǎn)化,鑒定質(zhì)粒陽性克隆及測序。rAAV2-Pim-1表達(dá)質(zhì)粒p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-Pim-1-3FLAG及包裝質(zhì)粒p AAV-RC和輔助質(zhì)粒p Helper,通過Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,純化獲得高滴度的rAAV2-Pim-1。大鼠玻璃體注射rAAV2-Pim-1,用免疫熒光組織化學(xué)檢測其感染視網(wǎng)膜的細(xì)胞類型;用Real-time PCR和Western blotting檢測Pim-1在視網(wǎng)膜中的表達(dá)。結(jié)果rAAV2-Pim-1質(zhì)粒構(gòu)建成功并且核苷酸序列比對正確;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后出現(xiàn)綠色熒光;包裝出的病毒濃縮滴度為5.7×1015vg/L。rAAV2-Pim-1組體內(nèi)感染視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)達(dá)71%,并感染少量無長突細(xì)胞,幾乎不感染星形膠質(zhì)細(xì)胞;Pim-1 mRNA和蛋白在視網(wǎng)膜中的表達(dá)約為rAAV2-EGFP組的6.61倍和2.29倍。結(jié)論成功構(gòu)建rAAV2-Pim-1病毒載體,并在感染后的大鼠視網(wǎng)膜RGCs中過表達(dá)Pim-1。
[Abstract]:Objective to construct a recombinant adeno-associated virus (rAAV2-Pim-1) vector carrying rat proto-oncogene Pim-1, and to detect the cell types of rat retina infected with rAAV2-Pim-1 and the expression of target gene Pim-1 in the retina. Methods p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-MCS-3FLAG vector and PCR product of Pim-1 gene were digested by Nhel and identified by agarose gel electrophoresis. The vector and the target gene DNA were recovered and transformed. The positive clones were identified and sequenced. The pAAV2-Pim-1 expression plasmid p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-Pim-1-3FLAG, the packaging plasmid p AAV-RC and the auxiliary plasmid p Helper were cotransfected into 293 cells by Lipofectamine 2000, and the high titer of rAAV2-Pim-1 was obtained. After vitreous injection of rAAV2-Pim-1, the cell types of the infected retina were detected by immunofluorescence histochemistry, and the expression of Pim-1 in the retina was detected by Real-time PCR and Western blotting. Results the rAAV2-Pim-1 plasmid was successfully constructed and the nucleotide sequence alignment was correct, the green fluorescence appeared after transfection of the plasmid, the virus concentration titer was 5.7 脳 1015vg/L.rAAV2-Pim-1, and the virus concentration titer was 5.7 脳 1015vg/L.rAAV2-Pim-1 in vivo infected with retinal ganglion cells (RGCs) up to 71%, and infected with a small number of Amphoid cells. The expression of Pim-1 mRNA and protein in the retina was about 6.61 times and 2.29 times of that in the rAAV2-EGFP group. Conclusion the rAAV2-Pim-1 virus vector was successfully constructed, and Pim-1 was overexpressed in the RGCs of the infected rat retina.
【作者單位】： 第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部人體解剖學(xué)教研室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(31271282;31571239)
【分類號】：R3416

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4 劉t熡，

本文編號：1816737