本文選題：二萜 + ent-柯巴基焦磷酸合酶�。� 參考：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：穿心蓮具有清熱解毒、涼血、消腫的功效,是很好的抗菌消炎藥。其主要的藥效成分為二萜類化合物穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯,但其生物合成途徑仍不清楚。穿心蓮內(nèi)酯的生物合成非常復(fù)雜,催化生成半日花烷型母核結(jié)構(gòu)的ent-柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase,簡(jiǎn)稱ApCPS)是其關(guān)鍵限速酶。近期有報(bào)道,從穿心蓮中克隆得到了一個(gè)(TPS基因(GenBank:JN216843.1),但其功能并未得到驗(yàn)證。本研究從植物體內(nèi)和體外兩個(gè)方面來(lái)鑒定該CPS的功能。ApCPS作為穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑中的早期調(diào)控基因,鑒定其生物功能可助我們了解穿心蓮內(nèi)酯類生物合成機(jī)制,也為將來(lái)利用該基因調(diào)控穿心蓮內(nèi)酯的生物合成,提高穿心蓮的藥效和規(guī)范化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。本研究以種植在人工氣候室的穿心蓮為材料,使用RT-PCR檢測(cè)ApCPS的組織特異性表達(dá),采用TLC和HPLC法測(cè)定各組織中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。利用大腸桿菌代謝工程鑒定ApCPS在體外的功能,并通過(guò)定點(diǎn)突變及生物信息學(xué)分析確定ApCPS的催化活性位點(diǎn)；在植物體內(nèi)采用VIGS沉默ApCPS基因,作者采用RACE技術(shù)克隆得到了一個(gè)穿心蓮中的八氫番茄紅素脫氫酶基因(ApPDS)作為VIGS的報(bào)告基因,通過(guò)RT-PCR和qRT-PCR分析基因沉默的效果及穿心蓮內(nèi)酯生物合成上游關(guān)鍵酶3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR),1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)以及牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸合成酶(GGPS)的基因表達(dá)情況,并使用HPLC法檢測(cè)ApCPS沉默后穿心蓮內(nèi)酯積累量的變化。同時(shí),為了深入分析ApCPS在穿心蓮內(nèi)酯生物合成的功能,作者還檢測(cè)了在茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)下ApCPS及其上游相關(guān)基因的表達(dá)模式。本論文的主要研究結(jié)果如下：1.ApCPS在各組織中均表達(dá),在葉、莖中表達(dá)較高,根中表達(dá)最低,和穿心蓮內(nèi)酯在各組織中的積累情況一致。MeJA能誘導(dǎo)ApCPS表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào),穿心蓮內(nèi)酯生物合成上游基因HMGR、DXS、GGPS也受MeJA誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào),并且響應(yīng)時(shí)間要早于ApCPS,表明穿心蓮內(nèi)酯生物合成基因受到MeJA的廣泛調(diào)控。2.作者從穿心蓮幼苗中克隆得到了ApCPS基因,重組表達(dá)確定ApCPS催化GGPP生成ent-CPP。將其保守域DXDD進(jìn)行定點(diǎn)突變后,ApCPS失去催化活性,表明DXDD執(zhí)行催化功能。對(duì)ApCPS序列分析發(fā)現(xiàn)其DXDD上游具有保守的精氨酸,表明其可能參與到次生代謝而不是初生代謝。3.用RACE技術(shù)從穿心蓮中克隆得到ApPDs,該cDNA全長(zhǎng)2224 bp,預(yù)測(cè)有一個(gè)1752 bp的完整開放閱讀框(序列已登錄GenBank,登錄號(hào)為：KP982892),編碼584個(gè)氨基酸。序列同源性分析表明ApPDS與芝麻、廣藿香、黃芩等其他植物的PDS有很高的同源性,該蛋白包含一個(gè)共有的氨基酸脫氫酶的輔酶結(jié)構(gòu)域NAD(H)-binding domain。利用半定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行組織表達(dá)模式分析,結(jié)果表明PDS基因在穿心蓮的根、莖、葉、花中均有表達(dá),表達(dá)量為葉花莖根。4.用VIGS方法在穿心功蓮體內(nèi)鑒定ApPDS的功能,構(gòu)建VIGS載體pTRV2-PDS,經(jīng)農(nóng)桿菌浸染穿心蓮葉片,植物表型觀察到葉片輕微變黃,qRT-PCR檢測(cè)到ApPDS基因下調(diào),表明VIGS技術(shù)在穿心蓮植株體內(nèi)被成功運(yùn)用。5.利用VIGS在穿心蓮葉片中沉默ApCPS,使其基因表達(dá)下調(diào)了49.80%,并且ApCPS基因的沉默負(fù)反饋調(diào)節(jié)GGPS的表達(dá),對(duì)HMGR.DXS的表達(dá)沒有影響。HPLC法檢測(cè)到ApCPS沉默15d后穿心蓮內(nèi)酯積累量下降了53.52%。通過(guò)植物體內(nèi)和植物體外兩方面的研究,鑒定了ApCPS的功能是參與到穿心蓮內(nèi)酯生物合成,催化GGPP生成ent-CPP作為穿心蓮內(nèi)酯生物合成的母核結(jié)構(gòu)；并且在穿心蓮體內(nèi)運(yùn)用VIGS成功沉默了ApCPS基因,使穿心蓮內(nèi)酯的積累量顯著減少,為研究穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑中其他基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:ApCPS was used as the early regulatory gene in the biosynthesis of andrographolide and its biological function was not validated . The study was carried out in vitro and in vitro to determine the content of andrographolide and dehydroandrographolide . The study was conducted to identify the activity of apCPS in vitro by using the method of TLC and HPLC .
The gene expression of ApCPS and its upstream related genes were determined by RACE technique .
In addition , the ApCPS gene is successfully silenced by using VIGS in Andrographitis , and the accumulation amount of andrographolide is reduced significantly , which lays a foundation for studying the function of other genes in andrographolide biosynthesis pathway .

【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S567.219

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1805127