本文選題：縊蟶 + 補體C3��； 參考：《上海海洋大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：縊蟶是我國主要的海水養(yǎng)殖貝類。貝類缺乏后天獲得性特異免疫,先天免疫是唯一的抵御屏障。補體作為最重要的先天免疫系統(tǒng)之一,在抵御疾病的過程中扮演著重要的角色。目前針對貝類補體C3及其亞型的序列和結(jié)構(gòu)研究最為常見,功能方面幾乎未見報道。本文對縊蟶補體C3三個亞型基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和溶血反應(yīng)進(jìn)行了研究。1.通過本實驗室已經(jīng)建立的轉(zhuǎn)錄組信息庫獲得縊蟶三個C3基因段片段序列并進(jìn)行克隆驗證,使用RACE技術(shù)獲得cDNA全長序列。三個基因基本信息分別為:ScC3全長6950bp,包括5256bp的開放閱讀框(ORF),翻譯為1752個氨基酸的編碼蛋白序列,分子量為197.34kDa;ScC3-2全長6294bp,包括5225bp的ORF,編碼為1741個氨基酸,分子量為196.13kDa;ScC3-3全長5965bp,包括5105bp的ORF,編碼為1701個氨基酸,分子量為191.39kDa�？O蟶三個C3基因的氨基酸組成存在較大差異,ScC3和ScC3-2具有67%的一致性,ScC3和ScC3-3具有35%的一致性,ScC3-2和ScC3-3具有38%的一致性。在蛋白二級和3D結(jié)構(gòu)中三者較為相似。比對三個C3基因的氨基酸結(jié)構(gòu)序列顯示三者均具有補體C3特征的8大結(jié)構(gòu)域,僅ScC3-3在硫酯鍵(有兩個氨基酸不保守)和α-γ鏈接位點(不存在)上存在差異。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果說明,ScC3和ScC3-2結(jié)構(gòu)相似度高,而ScC3-3與前二者相似度較低,但三者均是典型C3基因。2.通過實時熒光定量PCR檢測了C3基因在縊蟶健康組織和早期發(fā)育時期的表達(dá)模式。結(jié)果顯示ScC3、ScC3-2和ScC3-3均廣泛表達(dá),其中在幼體中具有一定的表達(dá)特征,且三個C3基因存在顯著差異。利用副溶血弧菌侵染縊蟶健康個體,熒光定量分析結(jié)果顯示ScC3在血淋巴(8h)和肝臟(72h)中顯著上調(diào),ScC3-2在血淋巴(8h)中顯著上調(diào),ScC3-3在血淋巴(24h)和肝臟(72h)中顯著上調(diào)。針對不同致病菌和不同的免疫組織,三個C3基因表達(dá)量存在顯著差異。利用溶壁微球菌侵染縊蟶健康個體,熒光定量分析結(jié)果顯示ScC3、ScC3-2和ScC3-3都在血淋巴(24h)中顯著下調(diào)在肝臟(4h)中顯著上調(diào)。結(jié)果揭示了三個C3基因均參與了免疫應(yīng)答,是有效的免疫基因,但是三者之間可能存在功能差異。3.多個理化因子被用于探索縊蟶血清溶血反應(yīng)最佳的條件。結(jié)果顯示溶血反應(yīng)依賴鈣鎂離子和弱堿性pH,溶血率受溫度(滅活溫度為50℃)、時間、縊蟶血清濃度(最佳比例為4:6縊蟶血清:2%兔血)和作用方式(最佳孵育方式為反應(yīng)全程低速震蕩)的影響。依據(jù)以上結(jié)果表明補體C3主導(dǎo)的縊蟶血清溶血反應(yīng)物理條件與高等哺乳動物存在一定差異,推測縊蟶等貝類開管式循環(huán)可能存在適應(yīng)其特點和生活環(huán)境的自身獨特的免疫方式。各個生化因子被用于探索縊蟶溶血反應(yīng)的啟動情況,顯示溶血反應(yīng)能被LPS、酵母聚糖、FLA和PGN激活,能被甲胺和PMSF抑制。4.制備篩選了三個C3基因特異性良好的抗體,并通過免疫沉淀(IP)實驗證明了抗體對各自基因存在特異抑制活性。使用特異性抗體抑制縊蟶血清中C3蛋白的活性,從而研究其主導(dǎo)的溶血功能。結(jié)果顯示兩個C3基因(ScC3和ScC3-2)具有主導(dǎo)溶血的功能。利用Western Blot和激光共聚焦分析了三個C3蛋白在抵抗異源抗原過程的蛋白定位,三者均于細(xì)胞或細(xì)菌表面發(fā)揮作用。以上顯示縊蟶ScC3和ScC3-2在功能上極其相似,而ScC3-3功能上差異較大;另外結(jié)合PMSF對縊蟶血清溶血反應(yīng)的影響表明縊蟶補體C3是一個不耐熱,需要激活,具有絲氨酸蛋白酶活性在細(xì)胞膜表面主導(dǎo)縊蟶血清完成溶血反應(yīng)的免疫功能基因。5.根據(jù)縊蟶的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明縊蟶補體系統(tǒng)缺乏C3下游的基因,設(shè)計引物使用同源重組法構(gòu)建了三個縊蟶C3基因的重組表達(dá)載體(pEGFP-N1),在小鼠RAW264.7細(xì)胞(小鼠巨噬細(xì)胞)中進(jìn)行模擬過表達(dá)實驗。三個C3基因在有效轉(zhuǎn)染前提下均能啟動小鼠補體系統(tǒng)。結(jié)合LPS和免疫復(fù)合物對縊蟶血清溶血反應(yīng)的影響以及IP實驗,表明縊蟶補體系統(tǒng)為需要經(jīng)過激活物(細(xì)菌多糖)活化的多分子參與的典型級聯(lián)反應(yīng)。
[Abstract]:The results showed that ScC3 , ScC3 - 2 and ScC3 - 3 had a high degree of similarity . The results showed that ScC3 - 2 and ScC3 - 3 had a high degree of similarity . The results showed that ScC3 - 2 and ScC3 - 3 had a high degree of similarity . Three C3 genes ( ScC3 and ScC3 - 2 ) were synthesized by Western Blot and laser confocal microscopy .

【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 杜文俊;王成東;王杰;李煉星;牛東紅;李家樂;沈和定;;縊蟶選優(yōu)群體和全同胞家系早期生長性能的比較[J];水產(chǎn)學(xué)報;2016年04期

2 金凱;牛東紅;王R，

本文編號：1804439