本文選題：H5N1亞型AIV + NA基因��； 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：H5亞型禽流感病毒(AIV)可引起家禽急性發(fā)病和大量死亡,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病毒在自然選擇條件下和疫苗選擇壓下很容易發(fā)生變異,形成適應(yīng)性的優(yōu)勢(shì)流行株。自1996年第一株亞洲H5N1亞型高致病性AIV在廣東省某發(fā)病鵝群被分離到以來,H5N1亞型AIV的NA基因出現(xiàn)了不同形式的缺失,且莖部第49-68位缺失20個(gè)氨基酸的缺失株占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),成為近年來流行的優(yōu)勢(shì)流行株。前期研究初步發(fā)現(xiàn),NA莖部缺失有助于H5亞型AIV拮抗干擾素,但相關(guān)機(jī)制仍不清楚。本研究以NA莖部缺失的H5亞型AIV為母本,按照已有的禽流感病毒NA基因莖部缺失模式或在NA莖部添加不同長(zhǎng)度氨基酸,構(gòu)建一系列只有NA莖部突變,其他基因與母本病毒骨架一致的全禽源NA突變的重組病毒,測(cè)定其生物學(xué)特性及拮抗干擾素能力的差異,分析NA莖部缺失在H5N1亞型AIV拮抗干擾素過程中的作用,對(duì)發(fā)揮拮抗干擾素的功能位置進(jìn)行定位,該研究對(duì)解析H5N1亞型AIV的進(jìn)化機(jī)制具有重要的學(xué)術(shù)意義。1 H5N1亞型AIV NA基因莖部缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性的測(cè)定以一株NA莖部49-68位缺失20個(gè)氨基酸和NS1 80-84位缺失5個(gè)氨基酸的H5N1亞型AIV(A/mallard/Huadong/S/2005)為母本病毒,構(gòu)建了 5株突變病毒,分別為NA基因莖部不缺失(rSNA+),缺失5個(gè)氨基酸(rSNA-5),缺失10個(gè)氨基酸(rSNA-10),缺失15個(gè)氨基酸(rSNA-15)和缺失20個(gè)氨基酸(rSNA-20),并測(cè)定了其生物學(xué)特性。結(jié)果顯示,5株突變病毒的TCID50、EID50和MDT值無顯著性差異。其生長(zhǎng)曲線表明,NA莖部加長(zhǎng)可增強(qiáng)H5N1亞型AIV在MDCK和CEF細(xì)胞上的復(fù)制能力,而NA莖部缺失會(huì)小幅度地提高H5N1亞型AIV在Vero細(xì)胞上的復(fù)制能力。神經(jīng)氨酸酶試驗(yàn)表明NA莖部越長(zhǎng)NA活性越高。空斑試驗(yàn)顯示隨著NA莖部的加長(zhǎng)空斑直徑增大。5株突變病毒以MOI=0.001分別感染CEF和MDCK細(xì)胞6h、12h和24h,應(yīng)用相對(duì)熒光定量PCR方法(以GAPDH為內(nèi)參)檢測(cè)細(xì)胞IFN-α和IFN-β的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,結(jié)果顯示,即在12h內(nèi),兩種細(xì)胞IFN-α和IFN-β mRNA的表達(dá)量隨著NA莖部的縮短而升高,在24 h隨著NA莖部的縮短而降低,表明病毒NA莖部的變化也可以影響細(xì)胞干擾素轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。因此,NA莖部缺失可以影響病毒的體外復(fù)制能力和神經(jīng)氨酸酶活性以及干擾素轉(zhuǎn)錄水平。2 NA基因莖部缺失對(duì)病毒拮抗干擾素能力的影響首先,用表達(dá)不同NA莖部長(zhǎng)度的pcDNA3.1(+)真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞24h后,加入不同濃度的IFN-β作用24 h,再用突變病毒感染IFN-β預(yù)處理過的Vero細(xì)胞,測(cè)定TCIDs0。結(jié)果表明,5個(gè)莖部不同長(zhǎng)度的NA真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)突變病毒拮抗干擾素的能力都有所提高,且真核質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-NA-15和pcDNA3.1(+)-NA-20對(duì)突變病毒拮抗干擾素的作用更明顯。再將5株突變病毒以MOI=0.001感染不同濃度IFN-β預(yù)處理過的Vero細(xì)胞,感染后72 h收集細(xì)胞上清,測(cè)定TCID50,結(jié)果顯示rSNA+、rSNA-5和rSNA-10在IFN-β濃度達(dá)到1600U時(shí),TCID5o滴度變?yōu)?;rSNA-15和rSNA-20在IFN-β濃度達(dá)到10000U時(shí),仍可以復(fù)制。該結(jié)果表明,NA分別缺失15個(gè)氨基酸和20個(gè)氨基酸均提高了H5N1亞型AIV拮抗干擾素的能力。3 NA基因莖部缺失對(duì)NS1表達(dá)的影響首先,為了獲得檢測(cè)NA和NSI蛋白的抗體,本研究通過擴(kuò)增NA-20和NS1基因,連接原核表達(dá)載體PET-32a(+)進(jìn)行原核表達(dá),純化蛋白后免疫小鼠,獲得NA-20和NSI的多抗血清。結(jié)果顯示,NA-20和NS1多抗血清的反應(yīng)性良好,不僅可以分別檢測(cè)NA和NS1自身蛋白,而且NA-20多抗血清還可以檢測(cè)莖部加長(zhǎng)蛋白NA+、NA-5、NA-10和NA-15。其次,5株突變病毒以MOI = 0.001感染CEF細(xì)胞,利用Western-blot測(cè)定在3 h、6 h、9 h、12 h和24 h時(shí)的NA和NS1蛋白表達(dá)水平。試驗(yàn)結(jié)果顯示,在不同時(shí)間點(diǎn),隨著NA莖部的缺失,NA蛋白的表達(dá)量逐漸減少而NS1蛋白的表達(dá)量逐漸增多。最后,各突變病毒感染以400 U IFN-β預(yù)處理的Vero細(xì)胞后,應(yīng)用相對(duì)熒光定量PCR方法(以M基因作為內(nèi)參)檢測(cè)NA和NS1基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示,NA莖部缺失20個(gè)氨基酸的毒株(rSNA-20),在不同時(shí)間點(diǎn)(6h、12h和24h)NS1mRNA的表達(dá)量均比其他各缺失株高,且大致呈現(xiàn)出隨著NA莖部的縮短N(yùn)S 1 mRNA的表達(dá)量逐漸增加的趨勢(shì),但是,NA的mRNA的表達(dá)量無顯著性差異。綜上所述,H5N1亞型AIV NA莖部缺失株拮抗干擾素的作用位點(diǎn)在莖部缺失15或20個(gè)氨基酸,可能是通過增強(qiáng)NSI的表達(dá)來拮抗干擾素的。
[Abstract]:The results showed that NA stem extension could enhance the replication ability of H5N1 subtype avian influenza virus . The results showed that NA stem extension could enhance the replication ability of H5N1 subtype avian influenza virus . The results showed that the deletion of NA stem could enhance the replication ability of H5N1 subtype avian influenza virus . The results showed that NA - 20 and rSNA - 10 increased the expression of NA - 20 and NSI . The results showed that NA - 20 and rSNA - 20 increased the expression of NA - 20 and NSI .

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1798014