本文選題：肝細胞性肝癌 + NET-1��； 參考：《南通大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的在肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中研究短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)沉默NET-1(TSPAN1)基因后的抑癌作用及其相關(guān)的分子機制。方法1.實時定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)和蛋白免疫印跡(Western Blots,WB)檢測不同HCC細胞株(MHCC97H、MHCC97L、HepG2、SMMC7721)中NET-1基因mRNA和蛋白的表達,篩選本研究的HCC靶細胞。2.構(gòu)建靶向NET-1的全位點核酸干擾(RNAi)文庫,篩選沉默NET-1的最佳靶點,進而構(gòu)建靶向NET-1的shRNA(NET-1 shRNA)轉(zhuǎn)染靶細胞。MTT、流式細胞儀檢測、Hoechst細胞凋亡檢測和Annexin V/PI染色流式細胞儀檢測NET-1 shRNA對HCC細胞增殖與凋亡的干預(yù)作用。3.通過cDNA基因芯片檢測NET-1 shRNA處理HCC細胞后基因表達差異,通過GO和KEGG富集分析探索差異基因的生物學(xué)功能及相關(guān)的信號通路。RT-qPCR、WB、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)和免疫熒光(Immunofluorescencetechnique,IF)共定位方法分別檢測靶細胞內(nèi)NET-1、MDM4、CHEK2、P53表達的相關(guān)性;并分別構(gòu)建NET-1、MDM4、P53過表達載體體外轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,Co-IP方法外源性檢測NET-1、MDM4、P53細胞內(nèi)環(huán)境中表達的相關(guān)性,探究NET-1 shRNA激活P53抑制HCC的分子機制。結(jié)果1.不同hcc細胞株(mhcc97h、mhcc97l、hepg2、smmc7721)中net-1mrna和蛋白的表達水平均顯著高于正常肝細胞(lo2)(p0.05)。在mhcc97h和mhcc97l細胞中的表達水平顯著高于hepg2、smmc7721細胞(p0.05),故選用高轉(zhuǎn)移潛能hcc細胞株(mhcc97h)和低轉(zhuǎn)移潛能hcc細胞株(mhcc97l)作為本文研究的靶細胞。2.成功構(gòu)建覆蓋net-1基因的rnai全位點文庫(143個克隆),在選取沉默效率較高的5個位點中進一步篩選并得到最優(yōu)沉默靶點,構(gòu)建net-1shrna。3.net-1蛋白定位于靶細胞胞質(zhì)或胞膜。與陰性對照shrnanc處理細胞相比,net-1shrna處理靶細胞后顯著下調(diào)了net-1mrna和蛋白表達水平,細胞被顯著阻滯在g1期,增殖能力下降,而細胞凋亡率顯著增加(均p0.05)。4.affymetrix基因芯片篩選出net-1shrna處理靶細胞后基因mrna表達水平呈現(xiàn)兩倍以上變化的差異基因。在mhcc97h細胞中有7393個,其中3389個基因表達上調(diào),4004個基因表達下調(diào);在mhcc97l細胞中有115個,其中55個基因表達上調(diào),60個基因表達下調(diào)。5.通過go和kegg富集分析net-1shrna處理后差異基因的主要生物學(xué)功能和相關(guān)的信號通路。在mhcc97h細胞中差異基因參與的生物學(xué)功能主要有:細胞間的信號傳導(dǎo)、細胞粘附、細胞凋亡、細胞周期、細胞增殖調(diào)控、血管生成等;參與的信號通路主要有:代謝途徑、癌癥通路、p53信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路、tgf-β信號通路、vegf信號通路、mtor信號通路等。在mhcc97l細胞中差異基因參與的生物學(xué)功能主要有:基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞增殖、生長調(diào)節(jié)、蛋白磷酸化調(diào)控、蛋白核轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、細胞周期阻滯調(diào)控等;參與的信號通路主要有:癌癥通路、粘著連接、jak-stat信號通路、notch信號通路、rig-i樣受體信號通路等。6.通過rt-qpcr、蛋白免疫印跡和免疫共定位等方法驗證基因芯片檢測的差異表達基因。與shrnanc處理相比,net-1shrna處理mhcc97h細胞中chek2mrna和蛋白表達量顯著增加(p0.05),雖然net-1和chek2的相互作用尚不明確,但chek2和p53蛋白在癌細胞中存在胞核內(nèi)共定位和蛋白相互作用。在net-1shrna處理mhcc97l細胞中mdm4mrna和蛋白表達量顯著減少,該蛋白表達定位于胞質(zhì)和胞核。通過內(nèi)源性免疫共沉淀方法檢測發(fā)現(xiàn)net-1與mdm4,mdm4與p53在hcc細胞中存在相互作用,且在HEK293T細胞中通過外源性檢測得到進一步驗證。結(jié)論1.構(gòu)建覆蓋NET-1基因全長的全位點RNAi文庫,并篩選得到高效沉默NET-1靶基因的RNAi靶點序列。2.本文設(shè)計與構(gòu)建的NET-1 shRNA轉(zhuǎn)染HCC細胞后能顯著下調(diào)細胞中NET-1的表達,抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡,顯示較好的抑癌作用。3.NET-1 shRNA轉(zhuǎn)染HCC細胞后可引起相關(guān)基因表達的顯著變化,其主要差異表達基因的生物學(xué)功能和所涉及到的信號通路均與細胞增殖、凋亡的基因調(diào)控有關(guān)。4.NET-1 shRNA下調(diào)癌細胞中NET-1基因后的抑癌作用分子機制在不同轉(zhuǎn)移潛能的HCC細胞中存在差異。分別通過上調(diào)高轉(zhuǎn)移潛能癌細胞中CHEK2表達,或下調(diào)低轉(zhuǎn)移潛能癌細胞中MDM4表達,殊途同歸最終激活了抑癌基因P53的機制來實現(xiàn)抑制增殖和促進凋亡的作用。5.NET-1是干預(yù)HCC的有效靶點。本研究為NET-1 shRNA進一步的開發(fā),用于臨床治療提供了理論和實驗依據(jù)。
[Abstract]:Objective to study the tumor suppressor effect and its molecular mechanism after the silent NET-1 (TSPAN1) gene of the short hairpin RNA (short hairpin RNA, shRNA) in hepatocellular carcinoma (HCC). Method 1. real-time quantitative PCR (Real-time) and protein immunoblotting The expression of mRNA and protein of NET-1 gene in different HCC cell lines (MHCC97H, MHCC97L, HepG2, SMMC7721), screening the HCC target cells in this study to construct the whole site nucleic acid interference (RNAi) library of target NET-1, screening the best target of the silent NET-1. Detection of T cell apoptosis and Annexin V/PI staining flow cytometry the interference of NET-1 shRNA on the proliferation and apoptosis of HCC cells.3. through the cDNA gene chip to detect the difference of gene expression after NET-1 shRNA processing HCC cells, and to explore the biological power and related signal pathways of the differential genes through GO and enrichment analysis. Co-Immunoprecipitation (Co-IP) and immunofluorescence (Immunofluorescencetechnique, IF) Co location method were used to detect the correlation of NET-1, MDM4, CHEK2, P53 expression in the target cells, and NET-1, MDM4, P53 overexpressed vectors were transfected into the cells in vitro. To explore the molecular mechanism of NET-1 shRNA activation of P53 to inhibit HCC. Results 1. the expression level of net-1mrna and protein in different HCC cell lines (MHCC97H, mhcc97l, HepG2, SMMC7721) was significantly higher than that of normal liver cells (LO2). The metastatic potential HCC cell line (MHCC97H) and the low metastatic potential HCC cell line (mhcc97l), as the target cell of this paper, have successfully constructed the RNAi full site library (143 clones) covering NET-1 gene, and selected the best silent target in the 5 loci with high silencing efficiency, and constructed the net-1shrna.3.net-1 protein to target the target. Cell cytoplasm or cell membrane. Compared with negative control shrnanc treated cells, net-1shrna significantly lowered the level of net-1mrna and protein expression after the target cell treatment. The cell was significantly blocked in the G1 phase and the proliferation ability decreased, while the apoptosis rate increased significantly (P0.05).4.affymetrix based gene chip screened the gene mRNA after the net-1shrna treatment of the target cells. There were 7393 differentially expressed genes with two times more than two times, of which 3389 genes were up-regulated, 4004 genes were downregulated, 115 in mhcc97l cells, 55 of which were up-regulated, and 60 genes were down regulated by go and KEGG rich set analysis of the major genes of differential genes after net-1shrna treatment. The biological functions of differential genes involved in MHCC97H cells are mainly signal transduction, cell adhesion, cell apoptosis, cell cycle, cell proliferation regulation, angiogenesis, and so on. The signal pathways involved are mainly metabolite pathway, cancer pathway, p53 signaling pathway, mitogen activated protein kinase Signal pathways, tgf- beta signaling pathways, VEGF signaling pathways, and mTOR signaling pathways. The biological functions of differentially genes involved in mhcc97l cells include gene transcription regulation, cell proliferation, growth regulation, protein phosphorylation regulation, regulation of protein nucleus transcription, and cell cycle arrest regulation, and the main signaling pathways involved are cancer pathways, Adhesion, JAK-STAT signaling pathway, Notch signaling pathway, RIG-I like receptor signaling pathway and other.6. through RT-qPCR, protein immunoblotting and immunoblotting were used to verify the differentially expressed genes of gene chip detection. Compared with shrnanc treatment, chek2mrna and protein expression in net-1shrna treated MHCC97H cells increased significantly (P0.05), although ne The interaction of T-1 and CHEK2 is not clear, but the co localization and protein interaction of CHEK2 and p53 proteins exist in the cell nuclei of the cancer cells. The expression of mdm4mrna and protein in the net-1shrna treatment mhcc97l cells is significantly reduced, and the protein expression is located in the cytoplasm and nucleus. NET-1 and MDM4, MDM4 are detected by endogenous immunoprecipitation method. Interaction with p53 in HCC cells and further verification by exogenous detection in HEK293T cells. Conclusion 1. construct a full site RNAi library covering the full length of NET-1 gene, and screen the RNAi target sequence of the target gene for highly silenced NET-1, which is designed and constructed by the NET-1 shRNA transfected to HCC cells. The expression of NET-1 in the cell can inhibit the proliferation of cancer cells and promote the apoptosis of cancer cells. It shows that the good tumor suppressor effect of.3.NET-1 shRNA transfection to HCC cells can cause significant changes in the expression of related genes. The biological functions of the main differentially expressed genes and the signal pathways involved are related to the proliferation of cells and the regulation of.4.NET-1 sh on the gene regulation of apoptosis. The molecular mechanism of the inhibitory effect of RNA on the NET-1 gene in cancer cells is different in the HCC cells with different metastatic potential. By up regulating the expression of CHEK2 in the cancer cells with high metastatic potential or decreasing the expression of MDM4 in the cancer cells with low metastatic potential, the mechanism of the tumor suppressor based on P53 is ultimately activated to inhibit proliferation and promote the growth of the cancer cells. The role of.5.NET-1 is an effective target for HCC intervention. This study provides a theoretical and experimental basis for further development of NET-1 shRNA for clinical treatment.

【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1795018