本文選題：ATM基因 + RNA干擾��； 參考：《延邊大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的通過(guò)大腸癌體外細(xì)胞模型,利用RNA干擾技術(shù),探討ATM基因沉默是否對(duì)大腸癌HT29細(xì)胞的放射敏感性有影響。方法設(shè)計(jì)并構(gòu)建ATM基因小分子干擾RNA(Small interfering RNA, siRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒pSilencer2.1-ATM,并轉(zhuǎn)染人大腸癌HT29細(xì)胞株作為陽(yáng)性組；ATM基因RNAi寡聚脫氧核糖核酸序列隨機(jī)重新排列后構(gòu)建非特異性siRNA,并轉(zhuǎn)染pSilencer2.1-nonspecific質(zhì)粒作為陰性組,未轉(zhuǎn)染為對(duì)照組。各組分別采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)檢測(cè)各組ATM基因的mRNA含量,蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot, WB)檢測(cè)每組ATM基因mRNA表達(dá)的蛋白質(zhì)含量,各組細(xì)胞經(jīng)8Gy X線照射后,分成兩部分,分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h,然后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(24 h、48 h)的陽(yáng)性組、陰性組以及對(duì)照組的細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果ATM基因siRNA真核重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建后成功轉(zhuǎn)染大腸癌HT29細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)證實(shí)陽(yáng)性組ATM基因的mRNA含量明顯下降；Western blot結(jié)果證實(shí)陽(yáng)性組細(xì)胞ATM基因所表達(dá)蛋白量明顯減少。經(jīng)X線照射后24h,陽(yáng)性組G1+Go期、G2+M期細(xì)胞比例較對(duì)照組均減少(t=-11.59,P0.001；t=-4.30,P0.001),但陰性組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差別(t=0.02,P=0.98；t=-0.03,P=0.97)；照射48h后,G1+Go期、G2+M期細(xì)胞比例同樣較對(duì)照組減少(t=-9.91,P0.001；t=-4.94,P0.001),陰性組與對(duì)照組同樣無(wú)明顯差別(t=0.08,P=0.94；t=0.09,P=0.93)；照射后24、48 h陽(yáng)性組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組(t=21.15,P0.001；t=32.94,P0.001),陰性組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差別(t=1.56,P=0.12；t=1.86,P=0.06)。結(jié)論1.通過(guò)構(gòu)建ATM基因siRNA的真核重組表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染人大腸癌HT29細(xì)胞,有效抑制了ATM基因的轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)。2.ATM基因被沉默后,增強(qiáng)了大腸癌HT29細(xì)胞的放射敏感性,其機(jī)制可能與抑制DNA損傷修復(fù)、使G1+G0期和G2+M期細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)失活、增加細(xì)胞凋亡率有關(guān)。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of ATM gene silencing on radiosensitivity of colorectal cancer HT29 cells by RNA interference in vitro. Methods the eukaryotic expression plasmid pSilencer2.1-ATM was designed and constructed for ATM gene small molecule interference RNA(Small interfering, and then transfected into human colorectal cancer HT29 cell line as a random rearrangement of RNAi oligodeoxyribonucleic acid sequence to construct nonspecific siRNAs. PSilencer2.1-nonspecific plasmid was transfected as negative group. No transfection was used as control group. Reverse Transcription-Polymerase Chain reaction (RT-PCR) was used to detect the mRNA content of ATM gene in each group, and the protein content of ATM gene mRNA in each group was detected by Western blotting. The cells in each group were irradiated by 8Gy X ray. The cell cycle distribution and apoptosis were detected by flow cytometry in the positive group, the negative group and the control group. Results after the construction of the eukaryotic expression plasmid of ATM gene siRNA, the mRNA content of ATM gene in the positive group was significantly decreased. The results showed that the expression of ATM protein in the positive group was significantly decreased. 24 hours after X-ray irradiation, the percentage of G 1 go phase G 2 M cells in the positive group was lower than that in the control group, but there was no significant difference between the negative group and the control group, but there was no significant difference between the negative group and the control group. 48 h after irradiation, the proportion of G 2 M phase cells in G 1 go phase in the positive group was also lower than that in the control group, and there was no significant difference between the negative group and the control group, and the proportion of the G 2 phase cells in the G 1 phase of G 1 go phase was also lower than that in the control group, and the percentage of the cells in the G 2 phase in the G 1 go phase was also lower than that in the control group, and there was no significant difference between the negative group and the control group. There was no significant difference between the control group and the control group, and there was no significant difference between the control group and the control group, and there was no significant difference between the negative group and the control group, and the apoptosis rate of the positive group was higher than that of the control group at 24 h after 48 h irradiation. The rate of apoptosis in the negative group was higher than that in the control group. There was no significant difference between the negative group and the control group, and there was no significant difference between the negative group and the control group. Conclusion 1. By constructing the eukaryotic expression plasmid of ATM gene siRNA and transfection into human colorectal cancer HT29 cells, the transcription of ATM gene was effectively inhibited and the expression of .2. siRNA gene was silenced, which enhanced the radiosensitivity of HT29 cells. The mechanism may be related to the inhibition of DNA damage and repair, the inactivation of cell cycle detection points in G1 G0 phase and G 2 M phase, and the increase of apoptosis rate.
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：1788696