本文選題：豬鏈球菌2型 + 小鼠模型��； 參考：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一種重要的人獸共患病病原,不僅嚴重制約著各國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,還威脅著人類的健康。在其現(xiàn)有的33種血清型(1-31型,33型和1/2型)中,以豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)毒力最強,流行最廣。目前,豬鏈球菌病(Swine Streptococcosis)的防治措施主要包括加強管理、接種疫苗和藥物防治,然而這些措施的效果有限。隨著動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,抗病育種方法可為豬鏈球菌病的防治提供新的思路。1.不同品系小鼠對豬鏈球菌2型易感性試驗小鼠感染SS2后的臨床特征與豬感染相似,且不同品系小鼠對SS2的易感性存在差異,可作為動物模型研究豬的感染過程。本試驗將B6,A/J和BALB/c三個品系小鼠分別隨機分為四組,其中三組作為試驗組,每組8-10周齡雌性和雄性小鼠各10只,共20只;剩余一組為對照組,8-10周齡雌性和雄性小鼠各3只,共6只。三組試驗組小鼠分別通過腹腔接種1mL劑量為5×107 CFU/mL、1×108 CFU/mL和5×108 CFU/mL的ZY05719菌液;對照組小鼠腹腔接種等量無菌THB培養(yǎng)液,觀察并記錄各組小鼠死亡情況;對3天內(nèi)死亡的小鼠立即剖取腦組織進行菌落臟器分布計數(shù),對15天后依然存活的小鼠統(tǒng)一采血測定抗體效價,同時,選取典型癥狀小鼠制作病理切片,從而確定對ZY05719菌株易感和抗病的小鼠品系以及合適的攻毒劑量。結(jié)果表明,在不同攻毒劑量下,B6和BALB/c小鼠對SS2的易感性存在差異,但均不顯著,兩品系小鼠對SS2均表現(xiàn)出較好的抗病性;當攻毒劑量為1×108 CFU/mL時,B6和A/J小鼠對SS2的易感性具有顯著差異,其中A/J小鼠表現(xiàn)為易感,B6小鼠表現(xiàn)為抗病。本試驗成功確定了 SS2的易感和抗病小鼠品系,為篩選豬抗豬鏈球菌病抗病相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。2.B6與A/J小鼠雜交F2代對豬鏈球菌2型易感性的GWAS分析全基因組關(guān)聯(lián)分析是利用統(tǒng)計學(xué)工具檢測全基因組范圍內(nèi)遺傳標記與可觀性狀間遺傳關(guān)聯(lián)的一種有效方法。本試驗選擇A/J和B6小鼠為親本,以非近交形式連續(xù)雜交兩代構(gòu)建F2代小鼠動物模型。對F2代小鼠每只腹腔注射1×108 CFU ZY05719菌液,根據(jù)死亡情況及其他輔助指標篩選抗病樣本和易感樣本共90個。提取樣本基因組DNA,質(zhì)檢合格后處理基因組DNA,設(shè)計比對方案,通過Affymetrix(?)Mouse Diversity Genotyping Array掃描分析獲得顯著SNP位點。從Manhattan圖中可以看出,2號染色體的qB、qC1.1區(qū)段上有明顯聚集的顯著關(guān)聯(lián)信號;與其他染色體相比,7號染色體qA1、qE3區(qū)段和12號染色體qF2區(qū)段的SNP位點也較為顯著,可能與小鼠對SS2的易感性有關(guān),應(yīng)給予重點關(guān)注。3.豬鏈球菌2型感染不同品系小鼠基因表達譜差異分析基因芯片可高通量檢測基因的功能及表達情況,還可單獨分析基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中單基因和多基因的調(diào)控作用。本試驗選用8-10周齡A/J和B6雄性小鼠為動物模型,每個品系小鼠隨機分為四組,每組3只小鼠。其中三組小鼠每只小鼠腹腔注射1×108CFUZY05719菌液,分別于攻毒2、4、8h時采血;剩余組小鼠作為空白對照注射等量THB培養(yǎng)液后采血。血液樣本提取RNA,質(zhì)檢合格后處理RNA樣本,設(shè)計比對方案,通過GeneChip(?)Mouse Transcriptome Assay 1.0掃描分析獲得差異表達基因。對獲得的基因進行通路分析和基因本體分析,結(jié)果表明,差異表達基因所參與的通路和功能包括B細胞和T細胞受體信號途徑、抗原的處理與遞呈、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、金黃色葡萄球菌感染等,與免疫關(guān)系密切,可能與抗豬鏈球菌病抗病性相關(guān),有待進一步研究。4.豬抗豬鏈球菌病抗病相關(guān)基因的分析為深入挖掘豬抗豬鏈球菌病抗病相關(guān)基因,綜合SNP芯片結(jié)果與基因表達譜芯片結(jié)果進行分析。以顯著SNP位點上下游500kb區(qū)段為拓展區(qū)間,篩選該范圍內(nèi)差異表達的基因,獲得候選基因集。根據(jù)曼哈頓放大圖和相關(guān)資料進一步挑選可能與抗豬鏈球菌病抗病相關(guān)的基因,利用CRISPR/Cas9基因定點編輯技術(shù)對這些基因進行功能驗證。ArhGAP15參與調(diào)節(jié)細胞骨架形態(tài)、抑制Rac1蛋白活性等活動,同時與細菌感染密切相關(guān);Epn1作為細胞內(nèi)吞作用的接頭,參與網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用;CD55可通過經(jīng)典補體途徑和替代補體途徑抑制攻膜復(fù)合體的形成,從而保護細胞免受攻擊。選擇這三種基因作為目的基因,采用CRISPR/Cas9技術(shù)在細胞水平上對其進行敲除,目前已初步獲得敲除ArhGAP15的單克隆細胞,為后續(xù)基因功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:In this experiment , three groups of mice were randomly divided into four groups : 1 mL dose of 5 脳 107 CFU / mL , 1 脳 108 CFU / mL and 5 脳 108 CFU / mL ZY05719 colony . In this experiment , we selected A / J and B6 male mice as their parents to study the function and expression of single genes and multiple genes in the whole genome .

【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.611

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