本文選題：MMDS + BolA3��； 參考：《廣西醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-Co V)是一種目前新發(fā)現(xiàn)的最大的RNA病毒,具有致病性強、致死率高的特點,其感染和傳播給人類帶來了新的挑戰(zhàn)。但是,目前關于MERS-Co V的致病通路的有關研究很少。micro RNA(mi RNA)作為一類新型的調控因子,在病毒致病過程中起到非常重要的作用。本課題從mi RNA角度對MERS-Co V的致病通路進行了研究,有利于進一步闡明MERS-Co V與宿主之間的相互作用,并為發(fā)現(xiàn)抗MERS-Co V的藥物提供新的靶點和策略。研究目的探索體內重要調控分子mi RNA在MERS-Co V致病過程中的作用及相關調控分子機制。研究方法1.MERS-Co V感染后的致病通路探索:(1)MERS-Co V感染致病相關mi RNA篩選:預測分析可能在MERS-Co V感染致病過程中具有重要作用的mi RNA。通過MERS-Co V感染的細胞mi RNA表達譜芯片的差異分析,選擇信號值有明顯變化的mi RNA,利用MTT實驗篩選出可能在MERS-Co V感染致病過程中具有重要作用的mi RNA,q PCR驗證MERS-Co V感染后該mi RNA在胞內的表達。(2)檢測mi R-374a對細胞增殖的影響:將mi R-374a mimics瞬時轉染入細胞,利用MTT實驗檢測mi R-374a的過表達對細胞增殖的影響。(3)預測分析mi R-374a可能靶向的靶基因:通過MERS-Co V感染的細胞m RNA表達譜芯片的差異分析,綜合在線分析(Targetscan,pichtar)等方法預測mi R-374a的靶基因,取預測交集,預測到mi R-374a可能靶向Bol A33’UTR,q PCR驗證分析的結果。(4)通過q PCR和Western blotting實驗方法檢測了mi R-374a在m RNA和蛋白質水平上對Bol A3表達的影響。(5)mi R-374a對Bol A3的靶向性研究:構建含有Bol A33’UTR的報告基因載體,與mi R-374a過表達載體共轉染入細胞,通過雙熒光素酶報告基因檢測mi R-374a對Bol A33’UTR的靶向性。2.Bol A3基因的克隆表達及特異性抗體制備:為了研究Bol A3在細胞中的功能,需要進行細胞中Bol A3蛋白表達檢測,因為沒有用于表達檢測合適的市售抗體,我們制備了Bol A3的多克隆抗體。(1)基因克隆:從人肺癌細胞系A549細胞中提取總RNA,通過RT-PCR擴增出Bol A3基因。(2)載體構建:將克隆基因構建入p QE30原核表達載體中。(3)蛋白誘導表達:在大腸桿菌中誘導蛋白表達,Western blotting方法鑒定帶有His標簽的重組Bol A3蛋白,分析蛋白表達形式。(4)蛋白純化:使用Ni柱親和層析法純化該蛋白。(5)抗體制備:程序免疫大耳白兔,耳緣靜脈采血分離免疫后兔血清,ELISA方法檢測血清中抗體滴度。(6)抗體鑒定:通過Western blotting方法,檢測制備的抗體與原核及真核表達的Bol A3蛋白結合特異性。3.Bol A3在細胞中的定位分布及對ATP生成的研究:(1)蛋白在各組織細胞中的表達:培養(yǎng)多種肺、肝、腎、腦等組織細胞系,裂解細胞,蛋白電泳,通過Western blotting方法利用制備的多克隆抗體檢測多種細胞系中Bol A3的內源性表達。(2)真核表達載體構建:PCR擴增出Bol A3基因片段,構建入p MD18-T載體,雙酶切從p MD18-T上切下Bol A3基因片段,構建入相同酶切的p EGFP-C1載體中。(3)蛋白定位:構建的EGFP-Bol A3融合表達的真核表達載體,瞬時轉染入細胞內,檢測到綠色熒光的表達。通過激光共聚焦實驗檢測綠色熒光的細胞與不同定位熒光標記的共定位情況,檢測Bol A3的細胞定位。(4)Bol A3表達抑制對細胞功能的影響:建立Bol A3抑制模型,篩選Bol A3 RNAi的有效區(qū)域,構建重組表達Bol A3 RNAi腺病毒,感染細胞后定量PCR法和Western-Blotting方法檢測細胞內Bol A3的表達抑制情況,MTT實驗檢測感染上述腺病毒抑制細胞內Bol A3表達后,對細胞增殖的影響。利用熒光法檢測抑制細胞內Bol A3表達對細胞ATP生成的影響。研究結果1.我們在中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-Co V)感染的細胞的表達芯片進行差異篩選中發(fā)現(xiàn):(1)MERS-Co V引起mi RNA差異表達譜分析,篩選出7個信號值有明顯上升的mi RNA,并從中篩選出1個可能在MERS-Co V感染致病中有重要作用的mi RNA mi R-374a,通過q PCR驗證了MERS-Co V能夠促進細胞內mi R-374a的表達;(2)功能實驗檢測證明mi R-374a在細胞中過量表達可以抑制細胞的增殖;(3)在MERS-Co V影響mi R-374a表達的研究中發(fā)現(xiàn),mi R-374a可能靶向調控Bol A33’-UTR。分析該分子可能在MERS-Co V感染致病通路中起到重要作用;(4)q PCR方法對MERS-Co V在細胞中調控Bol A3表達進行了鑒定,結果顯示MERS-Co V感染細胞后,能夠抑制細胞內Bol A3;(5)mi R-374a靶向Bol A3的鑒定:q PCR和Western blotting實驗驗證了mi R-374a能夠在m RNA和蛋白質水平上抑制Bol A3的表達;熒光素酶檢測報告基因結果說明mi R-374a能夠靶向抑制Bol A33’UTR。2.Bol A3蛋白在細胞中的功能研究:(1)抗Bol A3多克隆抗體制備和鑒定:轉化構建的Bol A3原核表達載體入M15感受態(tài),誘導蛋白表達,利用純化獲得的蛋白程序免疫大耳白,獲得免疫后兔血清,Western blotting方法鑒定所制備抗體對原核及真核表達Bol A3蛋白的結合具有高度特異性;(2)使用制備的抗體檢測到Bol A3在人肺、神經(jīng)、肝和腎細胞系中均有內源性表達,提示其在機體的功能廣泛;(3)將成功構建的EGFP-Bol A3融合表達的真核表達載體p EGFP-C1-Bol A3瞬時轉染入細胞,激光共聚焦實驗,檢測到Bol A3蛋白與線粒體標記物共定位于線粒體和細胞核;(4)建立Bol A3抑制模型,制備重組表達Bol A3 RNAi腺病毒,感染細胞,檢測其可以有效抑制細胞內Bol A3的表達。使用腺病毒感染細胞,檢測到抑制Bol A3的表達能夠促進細胞進行性死亡。對其機制進行研究發(fā)現(xiàn):抑制細胞內Bol A3的表達能抑制細胞內能量代謝中的重要分子--ATP的生成。研究結論1.本研究對mi RNA在中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-Co V)感染致病過程中的作用進行了探索。實驗結果顯示MERS-Co V感染細胞可以影響多種宿主細胞mi RNA的變化,其中MERS-Co V感染可通過促進細胞內mi R-374a的表達而靶向抑制Bol A3的表達,從而影響細胞生存。2.針對mi R-374a的靶基因,本研究對Bol A3基因在細胞中的分布、定位及其對ATP生成的影響進行了研究。研究結果表明Bol A3在肝臟、腎臟、肺和腦等多種組織細胞內均有表達,而且Bol A3的表達能夠定位于細胞線粒體。我們利用神經(jīng)細胞模型進行的實驗研究顯示,Bol A3表達的下降會影響細胞內能量代謝的重要物質ATP的形成,進而影響細胞的生存。實驗研究提示MERS-Co V感染導致Bol A3表達下降可能在MERS病毒感染致病中發(fā)揮一定的作用。
[Abstract]:This paper studies the pathogenic pathways of MERS - Co V in the pathogenesis of MERS - Co V infection . ( 3 ) To predict the target gene which may be targeted by mi R - 374a : The target gene of mi R - 374a was predicted by means of the differential analysis of the cell m RNA expression profiling chip of MERS - Co V infection , and the target gene of mi R - 374a was predicted to be targeted to Bol A3 . ( 5 ) Cloning and expression of Bol A3 gene were detected by means of q - PCR and Western blotting . ( 1 ) Cloning of Bol A3 gene was carried out . ( 3 ) Protein - induced expression : Protein expression was induced in E . coli . Western blotting was used to identify the recombinant Bol A3 protein with His tag . The expression of protein was analyzed by Western blotting . ( 3 ) Protein localization : The eukaryotic expression vector expressed by EGFP - Bol A3 fusion was transfected into the cells transiently , and the expression of green fluorescence was detected . ( 4 ) The effect of inhibition of Bol A3 expression on cell function was investigated by means of quantitative PCR and Western blotting . The expression of Bol A3 in human lung , nerve , liver and kidney cell line was investigated . The results showed that the expression of Bol A3 in human lung , nerve , liver and kidney could be inhibited . The decrease of Bol A3 expression can affect the formation of important substance ATP in intracellular energy metabolism , and then affect the survival of the cells . The experimental study suggests that the decrease of Bol A3 expression in MERS - Co V infection may play a role in the pathogenesis of MERS virus infection .

【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R373

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相關碩士學位論文 前1條

1 陳佳唯;miR-374a的發(fā)現(xiàn)及其靶基因在MERS-CoV感染致病過程中的作用探索[D];廣西醫(yī)科大學;2017年

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本文編號：1773229