本文選題：松材線蟲 + 致病機(jī)理　； 參考：《中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院》2016年博士論文

【摘要】：松材線蟲病(Bursaphelenchus xylophilus)是我國(guó)目前最嚴(yán)重的森林災(zāi)害,其致病機(jī)理研究的滯后和已有研究結(jié)果的爭(zhēng)議,嚴(yán)重制約了松材線蟲病的基礎(chǔ)研究進(jìn)展和有效防控技術(shù)的產(chǎn)出。松材線蟲侵入松樹后,引起松樹蒎烯類物質(zhì)代謝紊亂,松樹樹脂道內(nèi)蒎烯類物質(zhì)大量積累,從而誘導(dǎo)松樹空洞化現(xiàn)象的產(chǎn)生,最后導(dǎo)致松樹因缺水而死亡。松材線蟲在寄主體內(nèi)必須面對(duì)蒎烯等次級(jí)代謝產(chǎn)物的脅迫,松材線蟲對(duì)松樹次級(jí)代謝產(chǎn)物的分解代謝過程,是松材線蟲成功定殖和大量繁殖的必要條件,也是松材線蟲的致病過程。細(xì)胞色素P450(CYP450)基因及其調(diào)控途徑可能是松材線蟲應(yīng)對(duì)蒎烯類物質(zhì)脅迫過程中的重要基因之一。為了研究CYP450基因在松材線蟲致病過程中的作用,我們開展了以下研究:1)通過氣相色譜法和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)松材線蟲接種寄主松樹后,一個(gè)月內(nèi)松樹主要蒎烯類物質(zhì)代謝和松材線蟲CYP450基因表達(dá)模式之間的相關(guān)性,從而探究松材線蟲應(yīng)對(duì)寄主蒎烯類物質(zhì)脅迫時(shí)的關(guān)鍵細(xì)胞色素P450基因的作用。研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲接種馬尾松后,松樹蒎烯合成酶基因分別在第6天和第21天上調(diào)表達(dá),而寄主松樹體內(nèi)α-蒎烯和β-蒎烯的含量也具有兩個(gè)峰值,分別在第9天和第27天時(shí)最高。同時(shí),松材線蟲CYP33C9基因在接種后第12天和第15天大量表達(dá),CYP33C4基因在第21天表達(dá)量最高。松材線蟲的入侵引起松樹蒎烯合成酶基因上調(diào)表達(dá),生物合成大量蒎烯類物質(zhì),松材線蟲CYP450基因響應(yīng)松樹蒎烯類物質(zhì)的大量積累而上調(diào)表達(dá)。因此,松材線蟲CYP33C9和CYP33C4基因可能參與了松材線蟲蒎烯類物質(zhì)代謝過程,是松材線蟲致病相關(guān)基因之一。2)通過RT-PCR基因克隆方法克隆了松材線蟲CYP33C9和CYP33C4基因,與GenBank上松材線蟲全基因組同源性均為100%,其中CYP33C9基因?yàn)?504bp,而CYP33C4基因1506bp。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CYP33C9和CYP33C4基因均具有轉(zhuǎn)移酶活性,同時(shí)CYP33C4基因還具有氧化還原酶活性。另外,構(gòu)建了松材線蟲CYP33C9和CYP33C4基因RNAi載體,體外合成其dsRNA,通過ds RNA溶液浸泡后,成功干擾了松材線蟲CYP33C9和CYP33C4基因表達(dá)。3)通過RNAi技術(shù)沉默松材線蟲CYP33C9和CYP33C4基因后,寄主松樹蒎烯合成酶基因分別在第3d和第3、9、12d大量表達(dá),α-蒎烯和β-蒎烯分別在第6d和第15d含量最高。而未經(jīng)RNAi處理后的松材線蟲接種后,松樹體內(nèi)蒎烯合成酶基因在第6d和第21d大量表達(dá),α-蒎烯和β-蒎烯分別在第9d和第27d時(shí)含量最高。松材線蟲CYP33C9和CYP33C4基因沉默后松樹體蒎烯類物質(zhì)次級(jí)代謝時(shí)間提前,且不存在第二次蒎烯類物質(zhì)的積累。因此,松材線蟲CYP450基因的沉默會(huì)影響寄主蒎烯類物質(zhì)代謝,這類基因在松材線蟲與寄主互作中有重要作用。4)CYP33C9基因和CYP33C4基因沉默后,松材線蟲在松樹體內(nèi)種群數(shù)量較小,繁殖率降低。RNAi松材線蟲接種松樹后,松樹針葉萎蔫下垂,但針葉為綠色,樹干失水,植株瀕臨死亡,而未沉默CYP450基因的寄主松樹針葉萎蔫變黃脫落,樹干干枯,植株死亡。松材線蟲CYP33C9基因和CYP33C4基因沉默后,松材線蟲繁殖率和致病性降低。因此,CYP33C9和CYP33C4基因與松材線蟲繁殖率致病性相關(guān),是松材線蟲致病過程中的重要致病基因。5)低濃度α-蒎烯處理?xiàng)l件下,松材線蟲繁殖率降低,雌雄比較小且穩(wěn)定在較低水平;而高濃度α-蒎烯處理?xiàng)l件下,松材線蟲繁殖率較高,雌雄比增大;α-蒎烯和β-蒎烯混合處理?xiàng)l件下,松材線蟲繁殖率最低,雌雄比最小�？傊�,松樹主要次級(jí)代謝產(chǎn)物會(huì)影響松材線蟲繁殖率,而松材線蟲在適宜環(huán)境條件下產(chǎn)生大量雌性后代,不適宜環(huán)境條件下產(chǎn)生較多的雄性后代,松材線蟲通過雌雄比調(diào)解種群繁殖率,從而控制種群數(shù)量來適應(yīng)環(huán)境變化。6)通過RNAi技術(shù)沉默松材線蟲CYP33C9和CYP33C4基因后,與未RNAi處理的對(duì)照組相比,松材線蟲繁殖率降低,雌雄比變小。在不同濃度α-蒎烯和以及與β-蒎烯混合處理?xiàng)l件下,松材線蟲CYP33C9和CYP33C4基因RNAi后松材線蟲種群數(shù)量降低,雌雄比變小,繁殖率降低。因此,CYP33C9和CYP33C4基因RNAi后,松材線蟲對(duì)蒎烯類物質(zhì)脅迫的適應(yīng)性降低,這兩個(gè)基因可能參與了松材線蟲對(duì)蒎烯類物質(zhì)解毒代謝過程,是松材線蟲致病過程中的解毒基因之一。綜上所述,CYP33C9和CYP33C4基因與松材線蟲蒎烯類物質(zhì)代謝相關(guān),能提高松材線蟲在寄主體內(nèi)的適應(yīng)性,從而增強(qiáng)松材線蟲繁殖率和致病性,是松材線蟲致病過程中的重要關(guān)鍵致病基因之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S763.18

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本文編號(hào)：1766631