本文選題：腸桿菌科細(xì)菌 + CTX-M-55��； 參考：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景與目的由于新型廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物和第三代頭孢菌素在臨床上的廣泛使用,造成CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamases ESBLs)檢出率呈逐年上升趨勢,且在全球范圍內(nèi)傳播快速,分布廣泛。自1986年首次檢出CTX-M酶以來,在社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染中,CTX-M已成為最為流行的ESBL型別之一,現(xiàn)已在大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、變形桿菌等至少26種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了CTX-M酶。CTX-M-55酶屬于CTX-M-1組,自2004年首次在泰國發(fā)現(xiàn)產(chǎn)CTX-M-55型ESBLs的大腸埃希菌至今,已在韓國、中國、印度、日本、美國、英國、俄羅斯等數(shù)十個國家快速流行傳播,宿主菌包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、黏質(zhì)沙雷桿菌、沙門菌屬、志賀菌屬等十余種病原菌。除人類外,感染宿主還涉及家禽、牲畜、水源、蔬菜、野生動植物等,覆蓋人類生存生活的各個領(lǐng)域,對公共衛(wèi)生產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。因此,對CTX-M-55型ESBLs的傳播機(jī)制的研究有助于遏制其傳播,控制其轉(zhuǎn)移,臨床意義與社會價值重大。bla_(CTX-M)耐藥基因多數(shù)存在于質(zhì)粒,部分可定位于染色體上。耐藥基因是否定位于染色體,與菌株的型別有關(guān)系。定位于染色上的bla_(CTX-M)耐藥基因具有遺傳穩(wěn)定性。質(zhì)粒是導(dǎo)致bla_(CTX-M)耐藥基因水平傳播轉(zhuǎn)移的重要因素之一。接合型質(zhì)粒能通過接合傳遞在同種或不同種屬的細(xì)菌之間進(jìn)行穿梭,導(dǎo)致更多種類細(xì)菌的耐藥,甚至在局部造成耐藥細(xì)菌的大規(guī)模爆發(fā)和流行。bla_(CTX-M)耐藥基因的基因環(huán)境,及其周圍基因元件對耐藥基因的表達(dá),轉(zhuǎn)移和傳播都有著極為重要的調(diào)控作用。如:位于bla_(CTX-M)基因的上游的插入序列ISEcpI可使多種bla_(CTX-M)耐藥基因高水平表達(dá)并能夠攜帶耐藥基因在染色體與質(zhì)粒之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移,在不同菌種之間進(jìn)行傳播擴(kuò)散。插入序列IS26、IS903和ORF477也經(jīng)常與bla_(CTX-M)耐藥基因相關(guān)。這些可移動元件可隨機(jī)分布在bla_(CTX-M)耐藥基因上下游,并在不同的bla_(CTX-M)耐藥基因中組成不同形式的基因組件,共同或單獨(dú)作用于耐藥基因,對其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,其傳播進(jìn)行介導(dǎo)。CTX-M型ESBLs快速傳播的機(jī)制十分復(fù)雜。我們前期在臨床1株肺炎克雷伯桿菌中首次檢出bla_(CTX-M-55)型ESBLs,進(jìn)一步研究顯示CTX-M-55是CTX-M耐藥性進(jìn)程中重要一環(huán),但是對于本地區(qū)CTX-M-55是否具有特殊的轉(zhuǎn)移播散能力?是否具有獨(dú)特的上下游基因結(jié)構(gòu)?國內(nèi)外流行菌株間是否有相關(guān)性尚不清楚。本研究擬通過基因定位、高通量測序準(zhǔn)確分析明確基因環(huán)境;通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合實驗探究其傳播機(jī)制從而為臨床延緩或控制細(xì)菌耐藥性的升級提供有價值的線索。方法1.菌株收集收集2015年07月至2015年12月半年內(nèi),鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)菌室分離的耐三代、四代頭孢類抗菌藥物的革蘭陰性桿菌共357株,所有菌株均采用VitekⅡCompact鑒定至種。2.藥物敏感試驗和ESBLs表型確證實驗利用MIC法進(jìn)行藥敏試驗,參照2014年CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判讀。根據(jù)2014年CLSI推薦的ESBLs篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初步篩選并進(jìn)一步采用酶抑制劑增強(qiáng)試驗進(jìn)行確證。3.bla_(CTX-M-55)耐藥基因篩選及定位分析采用PCR技術(shù)對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,挑取陽性片段進(jìn)行測序分析,初步篩選bla_(CTX-M-55)耐藥基因陽性菌株。分別提取bla_(CTX-M-55)耐藥基因初篩陽性菌株的染色體和質(zhì)粒DNA,采用PCR擴(kuò)增bla_(CTX-M-55),再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和測序,確定bla_(CTX-M-55)耐藥基因在細(xì)菌中的位置。4.傳播轉(zhuǎn)移機(jī)制分析對定位于質(zhì)粒上的陽性菌株進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗。通過以上試驗分析bla_(CTX-M-55)耐藥基因的傳播轉(zhuǎn)移機(jī)制。5.耐藥菌株的同源性分析采用多位點(diǎn)序列分型(MLST)對bla_(CTX-M-55)耐藥基因陽性的菌株進(jìn)行同源性分析結(jié)果1.bla_(CTX-M-55)耐藥基因的檢出結(jié)果357株ESBLs陽性菌株中共13株病原菌攜帶bla_(CTX-M-55),且均為腸桿菌科細(xì)菌,其中包括大腸埃希菌7株,肺炎克雷伯桿菌3株,弗氏檸檬酸桿菌1株,黏質(zhì)沙雷桿菌1株和摩根摩根菌1株。非發(fā)酵菌中未有bla_(CTX-M-55)耐藥基因陽性菌株檢出。2.基因定位與質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合實驗結(jié)果基因定位分析結(jié)果顯示所有菌株的bla_(CTX-M-55)耐藥基因均被質(zhì)粒所攜帶且質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合實驗接合率為100%。3.基因環(huán)境檢測結(jié)果經(jīng)檢測,bla_(CTX-M-55)耐藥基因與其上下游基因元件共形成四種不同模式的基因組件。在13株bla_(CTX-M-55)耐藥基因上游均發(fā)現(xiàn)ISEcp1的存在,其中兩株被IS26插入截斷,一株被IS1294插入;在12株bla_(CTX-M-55)耐藥基因下游發(fā)現(xiàn)ORF477,另外1株下游為IS903。ISEcp1?-bla_(CTX-M-55)-?IS903基因組件是一種新型組合形式,在bla_(CTX-M-55)首次檢出。10株含有Int1類整合子,1株為Int2類整合子,2株未檢出整合子類型。13株bla_(CTX-M-55)耐藥基因陽性菌株中有5株同時攜帶blaTEM,兩株同時攜帶blaTEM和blaSHV。4.MLST分型情況對bla_(CTX-M-55)耐藥基因陽性的7株大腸埃希菌和3株肺炎克雷伯桿菌進(jìn)行MLST分型,共檢測出9種ST型別,其中兩株來自不同科室(消化內(nèi)科和ICU)的大腸埃希菌的ST型別一致(ST305),其與菌株的ST均不相同[ST305,ST182,ST381,ST446 and ST2(大腸埃希菌)and ST148,ST269 and ST37(肺炎克雷伯桿菌)]。結(jié)論1.CTX-M-55型ESBLs在本地區(qū)已然形成多菌種擴(kuò)散蔓延趨勢,尤以腸桿菌科細(xì)菌為甚,需引起臨床的高度警惕,嚴(yán)防出現(xiàn)院內(nèi)感染的爆發(fā)流行。2.可接合型質(zhì)粒、ISEcp1等bla_(CTX-M-55)基因周圍可移動元件是其在細(xì)菌間傳播轉(zhuǎn)移的主要因素。臨床應(yīng)增強(qiáng)bla_(CTX-M-55)基因攜帶菌監(jiān)測與防控工作,避免耐藥基因的局部爆發(fā)流行。
[Abstract]:CTX - M - 55 enzyme belongs to CTX - M - 1 group . CTX - M - 55 enzyme is one of the most popular ESBL types . CTX - M - 55 enzyme is one of the most popular ESBL types . This study was carried out by means of PCR to determine the position of the drug - resistant gene of CTX - M - 55 . The results showed that CTX - M - 55 was a key link in the drug resistance . and the local outbreak of the drug resistant gene is avoided .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R446.5

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本文編號：1764221