本文選題：阿爾茨海默病 + 七氟醚　； 參考：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是常見的神經(jīng)退行性疾病之一,AD的發(fā)病原因還不十分清楚,近年來,其發(fā)病率不斷增加,老齡可能是其重要誘發(fā)因素。目前研究表明,老年癡呆中阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)發(fā)病率高達(dá)50%-60%,嚴(yán)重影響了老年人的身體健康和正常的生活。AD已成為當(dāng)前老年醫(yī)學(xué)研究中的難題之一。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)水平的不斷提高,人均壽命相應(yīng)延長,高齡患者的疾病治療過程中,手術(shù)和麻醉的應(yīng)用愈加廣泛,全身麻醉對AD患者影響作用越來越受到人們的重視,成為麻醉學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)方向之一。動物研究表明,吸入麻醉能夠促進(jìn)β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein,Aβ)的聚集和神經(jīng)原纖維纏繞,引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡。有流行病學(xué)調(diào)查和研究發(fā)現(xiàn),全身麻醉藥使AD患病率明顯上升。全身麻醉已成為術(shù)后認(rèn)知功能障礙和AD的一個潛在的危險因素。有隊(duì)列研究結(jié)果則表明:手術(shù)和全身麻醉能夠增加阿爾茲海默病的發(fā)病率,但Dallas等人所做的針對麻醉與AD發(fā)病率相關(guān)性研究的薈萃分析發(fā)現(xiàn),盡管還缺高質(zhì)量的和長期的跟蹤隨訪研究,但就目前的研究結(jié)果來看,全麻手術(shù)病史并不增加患阿爾茲海默病的風(fēng)險。七氟醚是臨床上廣泛使用的吸入麻醉藥。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),將過度表達(dá)APP的人類H4神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞暴露在4.1%的七氟醚中6小時,能引起細(xì)胞凋亡,同時改變APP進(jìn)程,增加Aβ的聚集。動物研究表明,七氟醚對小鼠正常腦組織和孕鼠具有神經(jīng)毒性,能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)β-淀粉樣蛋白的聚集,有可能加劇AD的病理過程。然而,Callawayet al.等人研究顯示,暴露于七氟醚的幼鼠和老年鼠的學(xué)習(xí)記憶功能不會受到損害。還有研究則認(rèn)為七氟醚可以改善患者的術(shù)后認(rèn)知功能。由于實(shí)驗(yàn)室研究和動物研究結(jié)果存在諸多矛盾,進(jìn)一步研究常用吸入全麻藥七氟醚與AD疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,并對相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討顯得殊為重要。為此,本項(xiàng)目將以瑞典家系β-淀粉樣前體蛋白(APPswe)轉(zhuǎn)基因小鼠為研究模型,建立吸入麻醉AD動物模型,選擇臨床上最為常用的吸入麻醉藥七氟醚,采用分子生物學(xué)及行為學(xué)等方法,研究七氟醚麻醉對AD模型小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的影響及其機(jī)制,為AD患者和認(rèn)知功能障礙病人的臨床麻醉用藥提供理論指導(dǎo)和依據(jù)。第一部分APPswe轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及吸入麻醉動物模型的建立目的APPswe轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及建立吸入麻醉動物模型。方法在小鼠出生后10-15天,切尾,使用PCR技術(shù)對APPswe轉(zhuǎn)基因小鼠檢測APPswe基因表達(dá)情況。然后將90只APPswe轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分成三組:對照組,假手術(shù)組,七氟醚吸入組;對照組不進(jìn)行任何干預(yù),假手術(shù)組置于含100%O2麻醉箱中兩個小時,七氟醚吸入組置于含(2.5%)七氟醚的100%O2麻醉箱中兩個小時。動物自主呼吸,麻醉劑和氧氣濃度保持不變。使用電熱毯的溫度保持在(37±2℃)時,使用直腸溫度計每20分鐘測定一次。使用非侵入性的血壓監(jiān)測鼠尾套(BP-2000;VisitechSystems,Inc.,Apex,NC,USA)檢測血壓。使用小動物脈搏血氧儀監(jiān)測動物的心率和血氧飽和度,麻醉后取動脈血進(jìn)行血?dú)夥治�。結(jié)果PCR結(jié)果顯示,APPswe基因表達(dá)陽性。APPswe基因PCR產(chǎn)物堿基長344 kb。小鼠麻醉過程中未出現(xiàn)死亡,心率、呼吸等各項(xiàng)生命體征正常。各組實(shí)驗(yàn)小鼠心率、呼吸頻率和體溫均在正常范圍。結(jié)論通過本研究,我們對APPswe轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行了鑒定,成功建立了吸入麻醉轉(zhuǎn)基因動物模型,為后續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。第二部分七氟醚麻醉對APPswe轉(zhuǎn)基因鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響目的利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和Y-迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。方法利用Morris水迷宮監(jiān)測小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力,Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置為一圓形水池,直徑約為160厘米,深度50厘米,水深為30厘米,水池壁上以東、南、西、北4個相等距離的點(diǎn)將水池劃分為四個同樣大小的象限,將一直徑約為10 cm的平臺固定于水池的東南象限,水平面高出平臺1 cm。水溫恒定在23±1℃,實(shí)驗(yàn)前,將小鼠放置在一個封閉的,安靜的,黑暗的環(huán)境適應(yīng)半小時,然后麻醉后24小時,連續(xù)五天,每天四次進(jìn)行定位航行試驗(yàn)(PNT)和空間探索實(shí)驗(yàn)(SPT)。由計算機(jī)系統(tǒng)記錄行蹤,經(jīng)視頻分析軟件對結(jié)果進(jìn)行處理,統(tǒng)計小鼠游泳速度,逃避潛伏期、原象限滯留時間。Y-迷宮實(shí)驗(yàn):麻醉結(jié)束24小時后,在安靜,低光環(huán)境下,讓小鼠進(jìn)入Y-迷宮,三臂燈被點(diǎn)亮,并讓其適應(yīng)到3分鐘后關(guān)燈,然后打開小鼠不在一臂燈(隨機(jī)燈亮),5秒停留(燈亮為安全區(qū)),通電剩下兩臂(電壓45-55V),記錄小鼠到達(dá)安全區(qū)域所用時間(30秒內(nèi)有效,否則失敗)。燈持續(xù)亮30秒,然后關(guān)閉,一次實(shí)驗(yàn)結(jié)束,兩個實(shí)驗(yàn)之間間隔1分鐘,隨后重復(fù)每天固定訓(xùn)練20次,連續(xù)三天在同一時間段進(jìn)行訓(xùn)練。在這個實(shí)驗(yàn)中Y-迷宮判斷的標(biāo)準(zhǔn)為受電擊的小鼠直接跑到安全區(qū)被稱為“正確反應(yīng)”,逃到?jīng)]有亮燈的任何一臂都被認(rèn)為“錯誤反應(yīng)”。觀察動物的正確反應(yīng)的數(shù)目(每天20次訓(xùn)練正確的響應(yīng)次數(shù))和主動回避次數(shù)(燈不亮,5s內(nèi)完成逃避反應(yīng)的次數(shù))。結(jié)果水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,七氟醚麻醉前三組小鼠游泳時間,逃避潛伏期三組之間沒有明顯差異。七氟醚麻醉后三組間游泳速度亦無明顯差異。與對照組比較,吸入純氧的轉(zhuǎn)基因小鼠逃避潛伏期和原象限滯留時間的差異無顯著性(P0.05),表明吸入純氧2小時對APPSwe轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶功無明顯影響。然而,七氟醚麻醉組與對照組和假手術(shù)組比較,其學(xué)習(xí)曲線后移,轉(zhuǎn)基因小鼠的逃避潛伏期延長(p0.01),而小鼠在原來(初始)象限滯留的時間相應(yīng)縮短(P0.05),穿越平臺的總次數(shù)減少(P0.05),表明暴露于2.5%七氟醚2小時對APPSwe單轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有損害作用。此外,Y-迷宮實(shí)驗(yàn)顯示,七氟醚吸入組與假手術(shù)組和對照組比較正確反應(yīng)次數(shù)明顯減少(P0.01),主動回避次數(shù)亦明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),七氟醚麻醉能對AD轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生明顯損害,表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因小鼠的平均逃避潛伏期延長,在初始象限的滯留時間相應(yīng)縮短,和穿越平臺的總次數(shù)減少。Y迷宮實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),七氟醚麻醉組小鼠的正確反映次數(shù)和主動回避次數(shù)均明顯減少,表明七氟醚麻醉能夠?qū)D轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生損害。第三部分七氟醚麻醉對APPswe轉(zhuǎn)基因鼠海馬神經(jīng)元凋亡及相關(guān)信號通路的影響目的選取轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1區(qū)、CA3和DG區(qū)進(jìn)行TUNEL原位末端標(biāo)記凋亡染色觀察部位,觀察七氟醚對阿爾茲海默病轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響,并采用Western Blot法檢測線粒體凋亡基因Caspase-3和抑凋亡基因Bcl-xL的表達(dá)情況。方法TUNEL實(shí)驗(yàn)利用美國Roche凋亡檢測試劑盒。戊巴比妥鈉對小鼠進(jìn)行麻醉,腦組織切片包括CA1,CA3和DG三個區(qū)域,樣品脫蠟、脫水,加入蛋白酶K(Proteinnase K)工作液37℃反應(yīng)30min,浸入含有5%過氧化氫封閉液中,并在室溫下封閉15分鐘,再經(jīng)與制備的TUNEL反應(yīng)混合物反應(yīng)、顯色反應(yīng)10分鐘,PBS中漂洗封片。最后,觀察凋亡細(xì)胞,選取五個視野角熒光顯微鏡拍照計數(shù)。Western blotting檢測:首先組織蛋白提取,利用Bradford法檢測蛋白濃度。配制10%SDS凝膠電泳,用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,將轉(zhuǎn)好的膜放置于室溫下脫色搖床上,再用5%的脫脂牛奶封閉1h,稀釋一抗anti-caspase-antibody,anti-Bcl-xLantibody(1:1000)振蕩孵育4℃過夜,加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG二抗(稀釋度為1:2000),室溫振蕩孵育lh,anti-β-actin單克隆抗體作為內(nèi)參對照(Cell Signaling),最后用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影。結(jié)果TUNEL檢測CA1,CA3和DG區(qū)凋亡細(xì)胞的數(shù)目,結(jié)果顯示假手術(shù)組與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0,05),而七氟醚吸入組CA1,CA3區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組和對照組相比明顯增加(P0.01)。但是,DG區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)目三組間沒有明顯差異(P=0.0797)。通過Western blotting檢測每個組海馬區(qū)Bcl-xL和caspase-3蛋白表達(dá)水平,用目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值之比作為Bcl-xL、caspase-3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,假手術(shù)組與對照組相比Bcl-xL、caspase-3蛋白的表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而七氟醚吸入組與對照組和假手術(shù)組比較caspase-3蛋白水平明顯增加(P0.01),Bcl-xL蛋白水平明顯降低(P0.01)。結(jié)論七氟醚吸入麻醉小鼠AD模型中,TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示七氟醚能夠明顯增加海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元的凋亡,加重AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的損害程度。通過Western blotting實(shí)驗(yàn)顯示七氟醚吸入麻醉組caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯增加,Bcl-xL蛋白表達(dá)水平降低。提示七氟醚導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制與caspase-3的激活和Bcl-xL的下調(diào)有關(guān)。
[Abstract]:Background Alzheimer ' s disease ( AD ) is one of the most common neurodegenerative diseases . The incidence of AD is not very clear . In recent years , the incidence of Alzheimer ' s disease ( AD ) is increasing and aging may be an important factor . In this study , we studied the effects and mechanism of heptafluoroether anesthesia on the learning and memory function of AD model mice . It provided theoretical guidance and basis for the clinical anesthesia of AD patients and patients with cognitive impairment . The results showed that there was no significant difference in learning and memory ability of transgenic mice after anesthesia . Compared with the control group , the expression level of caspase - 3 was significantly increased ( P0.01 ) , and the level of Bcl - xL protein decreased significantly ( P0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R614

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本文編號：1760815