本文選題：尿細(xì)胞 + 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞�。� 參考：《濟(jì)南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)與人胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)高度相似:顯示ESCs樣的細(xì)胞形態(tài)、表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志物、擁有相似的基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)狀態(tài),具有體內(nèi)外三胚層分化能力。因此,iPSCs為體外研究細(xì)胞決定提供了有價(jià)值的模型,同時(shí)還可分化為病變的細(xì)胞從而建立特定的疾病模型用于篩選有效藥物、細(xì)胞治療。迄今為止,多種供體來源均可誘導(dǎo)獲得人iPSCs,比如皮膚、脂肪組織、外周血等等。然而,這些細(xì)胞的獲取是有創(chuàng)的。相反,已有研究小組發(fā)現(xiàn)不管是健康人或者患者的尿液會(huì)是獲得iPSCs更好的選擇。從尿液中提取細(xì)胞相比其他供體細(xì)胞具有壓倒性的優(yōu)勢(shì),比如安全、成本低、可多次獲取、易于被捐贈(zèng)者接受等。因而,尿源iPSCs(Urinary iPSCs,UiPSCs)可用于建立罕見病疾病模型進(jìn)而找到疾病有效的治療方法。目的:本課題旨在建立非整合Ui PSCs技術(shù)的實(shí)驗(yàn)平臺(tái),為后期罕見病模型的建立和發(fā)病機(jī)制的探究提供一種有效的方法。同時(shí)為了進(jìn)一步研究尿細(xì)胞重編程的機(jī)制和UiPSCs的生物學(xué)特性,因而在基因表達(dá)水平比較二者之間的差異,便于更好的利用Ui PSCs來取代ESCs在基礎(chǔ)研究、臨床實(shí)驗(yàn)中的重大位置。方法:(1)收集健康人的尿液樣品,分離培養(yǎng)尿細(xì)胞,初步分析影響尿細(xì)胞成功提取的因素;(2)利用攜帶OCT4、SOX2、KLF4、SV40LT的質(zhì)粒和能提高重編程效率的microRNA 302-367簇誘導(dǎo)尿細(xì)胞,采用無血清、無飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)條件獲得UiPSCs;(3)獲得i PSCs克隆后,本研究進(jìn)行了堿性磷酸酶染色、流式細(xì)胞術(shù)鑒定人ESCs標(biāo)志物的表達(dá)鑒定,完成了初步鑒定;(4)通過基因芯片檢測(cè)對(duì)照組ESCs與實(shí)驗(yàn)組UiPSCs基因表達(dá)譜的變化,在差異基因的基礎(chǔ)上分析GO、Pathway、基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)等,進(jìn)一步查閱相關(guān)文獻(xiàn),選取與重編程和分化密切相關(guān)的目的基因進(jìn)行q RT-PCR的驗(yàn)證。結(jié)果:(1)通過收集大量的尿液樣本,我們發(fā)現(xiàn)尿細(xì)胞的提取過程簡(jiǎn)單方便,可以作為獲取i PSCs的供體細(xì)胞,同時(shí)夜尿不適宜作為收集尿細(xì)胞的來源;(2)采用非整合、無血清、無飼養(yǎng)層細(xì)胞、無致癌基因c-MYC的重編程方法獲取了Ui PSCs克隆;(3)磷酸酶染色估算重編程效率發(fā)現(xiàn)存在個(gè)體差異性,同一個(gè)人不同批次的尿細(xì)胞效率也存在差異;流式細(xì)胞法鑒定表達(dá)人ESCs核抗原OCT4及表面標(biāo)記物TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-4,完成了UiPSCs的初步鑒定;(4)基因芯片分析結(jié)果顯示,對(duì)照組ESCs與實(shí)驗(yàn)組UiPSCs基因表達(dá)譜整體上相近,但還是存在一定差別,我們篩選出19個(gè)差異倍數(shù)最大的基因。從中選取了4個(gè)(TAF9B、NNAT、EGR1、PIWIL2)與維持干性和分化相關(guān)的差異基因通過q RT-PCR得到了驗(yàn)證。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)我們發(fā)現(xiàn),NNAT和EGR1在Ui PSCs中低表達(dá)有助于重編程反應(yīng)的完成,TAF9B是神經(jīng)分化的重要調(diào)控因子在UiPSCs中高表達(dá)(差異倍數(shù)高于9),可以部分解釋Ui PSCs在神經(jīng)分化方面具有的優(yōu)勢(shì)。結(jié)論:掌握了獲取Ui PSCs的非整合、無血清、無飼養(yǎng)層細(xì)胞、無致癌基因c-MYC的重編程方法,得到一株尿源非整合i PS細(xì)胞株,為后續(xù)疾病模式的建立和研究提供了基礎(chǔ)。通過比較ESCs與Ui PSCs基因表達(dá)譜的差異,我們發(fā)現(xiàn)二者存在顯著差異的基因,尤其是與干性的維持相關(guān),并且TAF9B的高表達(dá)可能是影響Ui PSCs神經(jīng)分化偏好性的分子基礎(chǔ)。本課題研究的ESCs與UiPSCs的分子學(xué)差異將推動(dòng)Ui PSCs在疾病模型、藥物發(fā)現(xiàn)、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。
[Abstract]:The aim of this study is to provide an experimental platform for the development of non - integrated Ui PSCs and to establish a specific disease model for the screening of effective drug and cell therapy . The results showed that : ( 1 ) The expression profiles of human ESCs and UiPSCs in the experimental group were identified by the method of non - integration , no serum , no feeder layer cells and no carcinogenic gene . By comparing ESCs and Ui PSCs gene expression profiles , we found that there were significant differences between ESCs and Ui PSCs .

【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R329.2

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1 汪偉;;基于數(shù)據(jù)庫語言實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的單因素重復(fù)測(cè)量方差分析[J];中國(guó)醫(yī)療設(shè)備;2013年11期

2 孫德利,舒琦瑾;基因表達(dá)譜在中醫(yī)藥研究中的意義[J];中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志;2002年01期

3 劉s，

本文編號(hào)：1752851